1、的存在。试验方法同。犛犖犜版权所有禁止翻制电子发售脑内接种致病指数犐犆犘犐测定滴度高于大于的新鲜感染尿囊液不超过,细菌检验为阴性,用等渗无菌盐水作倍稀释,不加添加剂如抗生素。脑内接种出壳的雏鸡,共接种只,每只接种。每观察次,共观察。每天观察应给鸡打分,正常鸡记作,病鸡记作,死鸡记作每只死鸡在其死后的每日观察中仍记作。犐犆犘犐是每只鸡内所有每次观察数值的平均数,计算方法见式犐犆犘犐狊不同样品应在吸水纸不同地方吸干。离心,将管壁上的残余液体甩到管底部,用微量加样器尽量将其吸干,份样品换用个吸头,吸头不要碰到有沉淀面,室温干燥约。不宜过于干燥,以免不溶。加入水,轻轻混。
2、>计,扩增产物长度为。上游引物下游引物样品的采集与前处理活禽和内脏组织见。血清或血浆用无菌注射器直接吸取至无菌离心管中。试验步骤样品核酸的提取在样品处理区,取狀个灭菌离心管,其中狀为待检样品数管阳性对犐材料和试剂器材型微量血凝板微量可调移液器等。,等渗磷酸盐缓冲液。结果及判定阳性对照出现目的条带,阴性对照和空白对照均未出现目的条带,试验成立。被检样品出现目的条带,判为阳性。被检样品未出现目的条带,判为阴性。对于扩增到的目的片段,需进步进行序列测定,从分子水平确定其致病性强弱。根据序列测定结果,对毒株基因编码的氨基酸序列进行分析,如果毒株蛋白的端有多个碱性氨。
3、离心离心管开口保持朝离心机转轴方向放置。轻轻倒去上清液,倒置于吸水纸上,吸干液体,不同样品应在吸水纸不同地方吸干。加入乙醇,颠倒洗涤。于条件下,离心离心管开口保持朝离心机转轴方向放置。轻轻倒去上清液,倒置于吸水纸上,吸干液体采集或处理的样品在条件下保存应不超过,若需长期保存,应放置冰箱,但应避免反复冻融。采集的样品密封后,采用保温壶或保温桶加冰密封,尽快运送到实验室。病毒分离培养鸡胚接种吸取除菌液经尿囊腔接种至少枚日龄日龄的鸡胚,枚,孵育。接种后每天检查鸡胚生长情况。病毒收获收集死胚濒死鸡胚和培养结束时存活的鸡胚,置冰箱致冷,无菌采集尿囊液。病毒鉴定血凝试验犎犃。
4、超过,若需长期保存,应放置冰箱,但应避免反复冻融。采集的样品密封后,采用保温壶或保温桶加冰密封,尽快运送到实验室。病毒分离培养鸡胚接种吸取除菌液经尿囊腔接种至少枚日龄日龄的鸡胚,枚,孵育。接种后每天检查鸡胚生长情况。病毒收获收集死胚濒死鸡胚和培养结束时存活的鸡胚,置冰箱致冷,无菌采集尿囊液。病毒鉴定血凝试验犎犃用检测尿反应在检测区进行。将中加样后的反应管放入荧光仪内,记录样品摆放顺序。反应参数设置反转录预变性,个循环个循环,荧光收集设置在第阶段每次循环的退火延伸时进行。注不同的荧光检测试剂可以选择不同的反应条件。犛犖犜版权所有禁止翻制电子发售引物。根据基因序列。
5、样品置于含抗生素的等渗磷酸盐缓冲液,组织和咽喉拭子保存液中含青霉素链霉素卡那霉素和制菌霉素,而粪便肠内容物和泄殖腔拭子保存液抗生素浓度应提高倍。加入抗生素后用磷酸氢钠调值到。粪便和搅碎的组织,用含抗生素的引物犛犖犜版权所有禁止翻制电子发售表续组分用量下游引物模板水总体积将以上反应体系瞬时离心充分混匀后,置仪内运行下列程序,个循环,个循环,个循环,个循环产物置保存。犘犆犚产物电泳制备琼脂糖凝胶板,取产物和上样缓冲液混匀,加入凝胶板加样孔,同时加阴性对照和阳性对照。电压电泳。紫外凝胶成像管理系统内观察结果照像。新城疫检疫技术规范。乙液磷酸氢钠磷酸氢钠,氯化钠,加蒸馏。
6、,溶解管壁上的,离心,冰上保存备用。提取的应在内进行扩增或保存于冰箱,将核酸转移至反应混合物配制区。犚犜犘犆犚扩增以下操作应在反应混合物配制区的冰盒上进行,按表配制反应体系。试验过程中要设立阳性对照阴性对照和空白对照。建议配制检测样品总数所需反应液,可以多配个样品使用量。表犘犜犘犆犚反应体系配置表组分用量缓冲液反转录酶酶抑制剂犜犪狇聚合酶上游。将中加样后的反应管放入荧光仪内,记录样品摆放顺序。反应参数设置反转录预变性,个循环个循环,荧光收集设置在第阶段每次循环的退火延伸时进行。注不同的荧光检测试剂可以选择不同的反应条件。采集或处理的样品在条件下保存应不。
7、和内脏组织见。血清或血浆用无菌注射器直接吸取至无菌离心管中。试验步骤样品核酸的提取在样品处理区,取狀个灭菌离心管,其中狀为待检样品数管阳性对照及管阴性对照之和,对每个管进行编号标记。每管加入裂解液,然后分别加入待测样品阴性对照和阳性对照各,份样品换用个吸头。再加入氯甲烷,混匀器上振荡混匀,室温静置。于条件下,离心。取与中相同数量的灭菌离心管,加入异丙醇预冷,对每个管进行编号。吸取离心后各管中的上清液转移至相应的管中,上清液至少吸取,注意不要吸出中间层,入溴化乙锭溶液,充分摇匀,备用。待琼脂糖冷却到左右,倒入制胶板并防止气泡产生,使琼脂糖厚度达,待凝胶完全凝固后去。
8、酸残基,蛋白的端即位为苯丙氨酸,可确定为新城疫强毒感染。多个碱性氨基酸指在位到位残基之间至少有个精氨酸或赖氨酸。实时荧光反转录聚合酶链反应荧光犚犜犘犆犚试剂和仪器试剂新城疫病毒荧光检测试剂盒试剂盒的组成说明及使用注意事项参见附录照及管阴性对照之和,对每个管进行编号标记。每管加入裂解液,然后分别加入待测样品阴性对照和阳性对照各,份样品换用个吸头。再加入氯甲烷,混匀器上振荡混匀,室温静置。于条件下,离心。取与中相同数量的灭菌离心管,加入异丙醇预冷,对每个管进行编号。吸取离心后各管中的上清液转移至相应的管中,上清液至少吸取,注意不要吸出中间层,颠倒混匀。于条件下。
9、抗凝血,放入等量阿氏液中摇匀,置冰箱中保存备用。临用前用洗涤次次,每次以离心,将血浆白细胞充分洗去至上清液清亮,用配成体积分数为的悬液。保存备用。犅犎犃犝标准新城疫病毒抗原根据抗原的血凝滴度,计算抗原的稀释倍数。例如表抗原滴度为∶,其个单位抗原滴度为∶,则将抗原稀释倍。将的抗原用做等量倍比稀释,使各孔依次含有,每孔补加,再加入鸡红细胞,反应新城疫检疫技术规范.囊液的血凝活性。呈阴性反应的尿囊液用另批日龄日龄的鸡胚至少再传代次,若结果仍为阴性,则判定新城疫病毒分离阴性。试验方法同。血凝抑制试验犎犐呈阳性的尿囊液用新城疫病毒标准阳性血清进行试验,以确认是否有新城疫病。
10、方法见附录。阿氏液红细胞保存液,配制方法见附录。鸡红细胞配制方法见附录。拭子脱脂棉球直径约,高压蒸汽灭菌。新城疫病毒标准阳性血清和标准阴性血清由指定单位提供。样品采集和制备活禽采集咽喉拭子和泄殖腔拭子需带有可见粪便,雏钠配制方法见附录。阿氏液红细胞保存液,配制方法见附录。鸡红细胞配制方法见附录。拭子脱脂棉球直径约,高压蒸汽灭菌。新城疫病毒标准阳性血清和标准阴性血清由指定单位提供。样品采集和制备活禽采集咽喉拭子和泄殖腔拭子需带有可见粪便,雏禽采集新鲜粪便。死禽无菌采集肺肾肠包括内容物脾脑肝心组织和骨髓,采集咽喉拭子。这些样品可单独或者混合存放,但肠内容物需单独处理。
11、掉梳子和两端封口物,将凝胶托盘放入电泳槽,加入电泳缓冲液使之高出凝胶。犛犖犜版权所有禁止翻制电子发售附录犆资料性附录中强毒株新城疫病毒荧光犚犜犘犆犚试剂盒组成说明及使用时的注意事项犆试剂盒的组成表犆试剂盒组成组成盒数量裂解液盒中强毒株新城疫病毒荧光反应液管酶颗粒带盖反应管装颗管管犜犪狇酶管水管阴性对照管阳性对照非感染体外转录管犆说明犆裂解液的主要成分为异硫氰酸胍和酚,为提取试剂,外观为红色,于保存犾犔犘犅犛配制甲液乙液犅阿氏液葡萄糖柠檬酸钠氯化钠蒸馏水加至溶解后,以柠檬酸调节至,分装,高压蒸汽灭菌,保存。犅鸡红细胞采集鸡或无禽流感新城疫等血凝抑制抗体的成年。
12、用检测尿囊液的血凝活性。呈阴性反应的尿囊液用另批日龄日龄的鸡胚至少再传代次,若结果仍为阴性,则判定新城疫病毒分离阴性。试验方法同。血凝抑制试验犎犐呈阳性的尿囊液用新城疫病毒标准阳性血清进行试验,以确认是否有新城疫病毒的存在。试验方法同。犛微量可调移液器。生物安全柜。试剂水配制方法见附录。裂解液保存。当禽出现上述病变时,应进行实验室确诊。实验室诊断病毒分离与鉴定设备材料和试剂器材生物安全柜离心机型微量血凝板微量可调移液器恒温箱等。犛犖犜版权所有禁止翻制电子发售抗生素青霉素链霉素卡那霉素和制霉菌素等。日龄日龄鸡胚日龄雏鸡。,等渗磷酸盐缓冲液配制方法见附录。磷酸氢钠配。
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SNT 0764-2011 新城疫检疫技术规范