能及其基因克隆与表达研究重庆西南大学特种经济动物饲养专业，黄宁生物序列比对苏州大学，，，，，常彦忠，钱忠明铜蓝蛋白与脑铁代谢生理科学进展，，，恒温孵育器中加热秒钟后，再在冰中放置分钟。加入培养基，振荡培养分钟。离心，吸去上清，将所有菌液吹打混匀。在含的琼脂平板培养基上加入涂匀晾干，取菌液到平板上，置于恒温培养箱中过夜培养。菌液鉴定挑选白色菌落，使用法确认载体中插入片段的长度大小。用菌液做模板进行鉴定，反应体系如下菌液水反应条件为预变性变性退火延伸终延伸个循环。测序与分析从电泳结果为阳性的菌液中，取加到含的中，增菌培养，委托上海生物工程有限公司进行测序。将所得核苷酸序列输入进行同源性比较。结果总的提取分别在每个时间点的每个浓度组中采尾鱼取样，提取所有组织中的总，用微量分光光度计对所有的样品定量，所得值在之间，浓度均大于，说明总的提取很成功，可以进行扩增。铜蓝蛋白的目的基因片段的扩增以提取的总为模板进行反转录，在用所得为模板用目的基因引物进行反应。用的琼脂糖凝胶电泳检测铜蓝蛋白目的基因片段的大小与引物设计时预测的致。如图所示图电泳结果菌液鉴定电泳纯化的产物分别与连接，转入а感受态细胞中，蓝白斑筛选出阳性菌落，培养后进行菌液鉴定，用的琼脂糖凝胶电泳检测，如图所示图铜蓝蛋白基因菌液电泳结果重组质粒测定及分析扩增后的产物经纯化连接转化鉴定后，所得目的基因片段测序结果为目的基因片段大小为。黄河鲤铜蓝蛋白核酸序列的同源性比较与进化树将本试验所获得的黄河鲤铜蓝蛋白基因的部分序列与上登录的不同物种的铜蓝蛋白的核酸序列进行对比分析，结果表明黄河鲤铜蓝蛋白的核酸序列与鲫鱼的同源性最高，达到，序列来源为与鳙鱼铜蓝蛋白核酸序列的同源性达到，序列来源为与斑马鱼铜蓝蛋白核酸序列的同源性达到，序列来源为。图黄河鲤与其他物种的铜蓝蛋白的进化树，，，，，，，，，，，，，，在进化树中为马，为灰狼，为山猪，为绵羊，为欧洲野兔，为小家鼠，为普通猕猴，为奥尼罗非鱼，为眼斑雪冰鱼，为斑马鱼，为鳙鱼，为黄河鲤，为鲫鱼。用程序对铜蓝蛋白核酸序列进行分析建立了进化树图。从进化树可以看出，黄河鲤与鲫鱼鳙鱼斑马鱼眼斑雪冰鱼及奥尼罗非鱼聚在起，说明鱼类之间亲缘关系最近，其中黄河鲤与鲫鱼亲缘关系最近，黄河鲤与鳙鱼斑马鱼亲缘关系稍次，眼斑雪冰鱼与奥尼罗非鱼聚成束，与黄河鲤的亲缘关系较近小家鼠与欧洲野兔绵羊山猪灰狼马普通猕猴又聚成类，灰狼与马山猪绵羊聚成类，与黄河鲤亲缘关系最远，普通猕猴与小家鼠欧洲野兔与黄河鲤亲缘关系稍远。讨论铜蓝蛋白作为个重要的亚铁氧化酶，它在机体铁转运和铁平衡中起着重要，无铜蓝蛋白血症患者在肝细胞和网状内皮细胞中铁浓度显著增高，血中铁蛋白浓度增高铁离子浓度下降，大多数患者有轻度贫血。对蛋白质进行基因克隆和测序，可以了解蛋白质的核酸序列及基因结构，为该蛋白质开发利用提供有力支撑。在犬铜中毒研究过程中克隆出了犬铜蓝蛋白的部分序列。等分离出小鼠肝脏组织的铜蓝蛋白，发现小鼠铜蓝蛋白核酸序列与人铜蓝蛋白的同源性达到了。本试验通过方法从黄河鲤组织中成功克隆出了黄河鲤铜蓝蛋白基因部分序列，长约，填补了这蛋白质核酸序列的空白。将本试验所获得的黄河鲤铜蓝蛋白基因的部分序列与上登录的不同物种的铜蓝蛋白的核酸序列进行对比分析发现黄河鲤铜蓝蛋白的核酸序列与鲫鱼的同源性最高，达到，与鳙鱼铜蓝蛋白核酸序列的同源性达到，与斑马鱼铜蓝蛋白核酸序列的同源性达到。用程序对铜蓝蛋白核酸序列进行分析建立了进化树发现，与其他物种相比，不同种属间铜蓝蛋白核酸序列的同源性很低，表明铜蓝蛋白基因在不同物种间存在定甚至是较大差异，在同种属中同源性则较高。这结果与传统的研究结果相符。多年来，人们直认为铜蓝蛋白是引起细胞铁释放的关键蛋白，主要基于它具有亚铁氧化酶活性，能催化二价铁离子氧化为三价铁离子，帮助三价铁离子与转铁蛋白相结合，从而参与细胞铁释放。等于年首先提出铜蓝蛋白在铁代谢中的作用是帮助细胞铁释放，多年来这种观点直被人们广为接受，无铜蓝蛋白血症的发现进步论证了这种观点的正确性，。但近年有学者对铜蓝蛋白在铁代谢中的作用提出了不同的观点，他们认为铜蓝蛋白的作用是促进细胞铁摄入。等对人肝癌细胞的研究发现，铁缺乏能增加铜蓝蛋白基因的转录表达，结果显示铜蓝蛋白参与铁的摄入。等对细胞的研究，等对神经胶质瘤细胞的研究也发现了相同的现象，。对黄河鲤铜蓝蛋白在铁代谢中作用的深入研究有助为解决这争论提供新的证据。致谢本试验研究是在河南农业大学生命科学研究中心完成的，论文写作在指导老师高春生老师悉心指导帮助下完成，在此期间河南农业大学牧医工程学院硕士研究生乔晶晶给予极大支持和帮助，在此表示由衷的感谢,参考文献，，谢及生理功能等诸多方面展开了大量研究，尤以该蛋白与人类部分疾病之间的联系研究较多，并取得了不少的成就。在鱼类铜蓝蛋白基因序列的研究目前主要集中在斑马鱼鲫鱼和鳙鱼，并获得了部分的铜蓝蛋白核酸序列。目前还未见黄河鲤铜蓝蛋白核酸序列的报道，因此，本试验对黄河鲤铜蓝蛋白核酸序列进行克隆和序列分析，为进步研究铜蓝蛋白的结构和功能奠定基础。试验材料试验动物黄河鲤取自黄河鱼场，体长，体重左右。试验前停喂，使其尽量排尽体内粪便，避免残饵和粪便对金属形态影响。水温，每天换次水，气泵充气保证供氧。试验仪器试验仪器名称仪器来源洁净工作台上海博讯实业有限公司医疗设备厂电泳设备北京市六仪器厂仪公司台式高速离心机公司台式高速低温离心机公司智能生化培养箱宁波莱夫科技有限公司电子天平北京塞多利斯天平有限公司凝胶成像系统北京誉朗诺科技有限公司微型分光光度计公司试验试剂和均购自康为世纪公司，异丙醇氯仿无水乙醇等均为国产分析纯试剂，枪头管等均购自公司。试验用溶液的配制方法氨苄青霉素储存液配制方法称取置于塑料离心管中。加入灭菌水充分混合溶解后定容至。滤膜过滤除菌，分装后保存备用。液体培养基配制方法称量下列试剂，置于烧杯中加入约的去离子水，充分搅拌溶解。滴加约，调节值至。加去离子水将培养基定容至。高温高压灭菌后，冷却至室温。加入后均匀混合后于保存。缓冲液配制方法称量下列试剂置于烧杯中。向烧杯中加入约的去离子水，充分搅拌溶解。加入的醋酸，充分搅拌。加去离子水将溶液定容至后，室温保存。载体和宿主菌克隆载体为载体，购自宝生物大连有限公司宿主菌株为，购自天根生化科技有限公司。试验方法总的提取取黄河鲤肝胰脏，经生理盐水处理后，锡纸包裹经液氮速冻后冻存于冰箱备用。在经水处理过的试管加入，取的组织浸入中，匀浆，转至的管中，充分混匀，冰上静置再加入氯仿，剧烈震荡后室温静置，于离心取上层水相于新的管中，加入同体积的异丙醇，颠倒混匀后静置，离心弃上清，沉淀用的乙醇洗涤，震荡以悬浮沉淀，离心，弃上清，倒扣管室温干燥，干燥后用适量的无酶水溶解即得总提取液。将提取的总在微量光分光光度计下测其吸光度值，根据样品在波长处的吸光度确定总提取液中的浓度，之后稀释使其浓度在，保存。反转录第链的合成反应体系