1、物直肠深部约取少量粘液粪便，盛于灭菌容器中。样品的保存和运输待检样品在保存不应超过保存不超过个月以下长期保结核病病原菌实时荧光检测方法.中，振荡混匀形成悬浮菌液。血样用无菌注射器或真空采血管，无菌自动物静脉采血，无菌分离血清，用无菌注射器或真空采血管，无菌自动物静脉采血，将血液直接滴人抗凝剂中，并立即连续摇动，充分混合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液，或。每血液加抗凝剂。条件允许时，建议优先采集全血，以更有利于富集菌体。奶样无菌采集奶液于灭菌的容器中。般以后段奶液含菌量较多，早晨挤出的奶液含菌量最高。痰液动物痰液采集动物咯痰极少，宜在清晨采集，用橡胶管自口腔伸人至气管内，外接注射器吸取痰液。亦可取咳出的痰块。人痰液采集采集清晨从肺深处咳出的痰液。用灭菌容器密闭送检。
2、疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位中华人民共和国广东出入境检验检疫局华中农业大学中国检验检疫科学研究院北京盈思科技发展有限公司。本标准主要起草人陈茹刘中勇杨国海郭爱珍曾碧健韩雪清高小博林祥梅吴晓薇。范围结核病病原菌实时荧光检测方法本标准规定了结核分枝杆菌复合群结核分枝杆菌牛分枝杆菌实时荧光检测方法的技术要求和操作规范。本标准适用于快速检测细菌培养物血样奶样痰液组织器官粪便等临床样品中结核分枝杆菌复合群结核分枝杆菌牛分枝杆菌。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文引物结核分枝杆菌复合下游引物群探针上游引物结核分枝杆菌复舍下游引物群探针，上游引物结核分枝杆菌下游引物探针卜上游引物牛分枝杆菌下游引物探针探针端标记的报告荧光基团及。
3、用量达到肉眼可见，菌团大小不超过接种环菌样，放到中，振荡混匀形成悬浮菌液。血样用无菌注射器或真空采血管，无菌自动物静脉采血，无菌分离血引物结核分枝杆菌复合下游引物群探针上游引物结核分枝杆菌复舍下游引物群探针，上游引物结核分枝杆菌下游引物探针卜上游引物牛分枝杆菌下游引物探针探针端标记的报告荧光基团及，端标记中，振荡混匀形成悬浮菌液。血样用无菌注射器或真空采血管，无菌自动物静脉采血，无菌分离血清，用无菌注射器或真空采血管，无菌自动物静脉采血，将血液直接滴人抗凝剂中，并立即连续摇动，充分混合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液，或。每血液加抗凝剂。条件允许时，建议优先采集全血，以更有利于富集菌体。奶样无菌采集奶液于灭菌的容器中。般以后段奶液含菌量较多，早晨挤出的奶液含菌量最。
4、合群和或荧光阳性反应，均判为结核分枝杆菌复合群核酸检测阳性。呈结核分枝杆菌复合群核酸检测阳性的样品，继续进行结核分枝杆菌荧光反应和牛分枝杆菌荧光反应以检测鉴定感染的菌种检测反应呈阳性的对应判为结核分枝杆菌核酸检测阳性或牛分枝杆菌核酸检测阳性。液磷酸氢钠溶液称取磷酸氢钠。，加双蒸水溶解，定容至。液磷酸氢钠溶液称取磷酸氢钠，加双蒸水溶解，定容至。分别量取液液，混合即成磷酸缓冲液。称取柠檬酸钠痰液前处理在痰液样品中加入倍倍体积氢氧化钠溶液，振荡混匀，室温放置，问或振荡混匀，使其充分液化无明显固状物并且吸出时无拖丝现象即为液化完全若液化不完全，可适当再加入少量氢氧化钠溶液直至液化完全离心弃上清，加，充分振荡混匀，离心，弃上清，重复本步骤次收集沉淀物，继续进行核酸提取。
5、枝杆菌复合群结核分枝杆菌牛分枝杆菌实时荧光检测方法的技术要求和操作规范。本标准适用于快速检测细菌培养物血样奶样痰液组织器官粪便等临床样品中结核分枝杆菌复合群结核分荡混匀，使其充分液化无明显固状物并且吸出时无拖丝现象即为液化完全若液化不完全，可适当再加入少量氢氧化钠溶液直至液化完全离心弃上清，加，充分振荡混匀，离心，弃上清，重复本步骤次收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置贮存备用。组织器官前处理取适量组织样品剔除脂肪被膜，剪碎，按的比例加入柠檬酸钠磷酸缓冲液例如，组织样品，加入缓冲液，充分研磨加等量氢氧化钠溶液，继续研磨，使组织液化移人离心管，充分振荡，温浴取上清避免吸取粗渣，离心弃上清，加等量，振荡混匀，使沉淀充分悬浮，离心，弃上清，重复本步骤次收集沉淀物，继。
6、，端标记注意事项检测过程防止交叉污染应注意的事项见附录。附录规范性附录试剂的配制先配制液液。液。溶液称取水合磷酸氢钠。，或水合磷酸氢钠。，溶于蒸馏水中，定容至。液。溶液称取十水合磷酸氢钠。，或水合磷酸氢钠。，溶于蒸馏水中，定容至。结核病病原菌实时荧光检测方法。粪样前处理取粪样，按的比例加入硫酸溶液例如粪样，加液体充分振荡混匀，室温静置取上层约液体避免吸取粗渣，离心，取上清，离心!弃上清，加等量，振荡混匀，使沉淀充分悬浮，离心，弃上清，重复本步骤次收集沉淀物，继续进行核酸提，判为阳性反应。否则判为荧光阴性反应。必要时，对初次检测呈荧光阳性反应的样品进行重复检测。样品检测及判定可根据需要同时进行组组荧光检测。建议先进行结核分枝杆菌复合群荧光检测样品呈结核分枝杆菌。
7、。组织器官采集动物下颌咽后支气管肺特别是肺门及肺门淋巴结纵隔和肠系膜淋巴结，以及病变组织器官如肝睥肺等。粪便采集混有粘液血液粘膜的粪便，或用刮匙从动物直肠深部约取少量粘液粪便，盛于灭的淬灭基团可根据荧光仪设备等具体情况另行选定。材料与试剂仪器与耗材接种棒。无菌注射器或真空采血管。灭菌容器。橡胶管。刮匙。级生物安全柜。荧光仪。恒温水浴锅室温至。离心机最高离心力达以上。混匀器。冰箱。天平精密度达千分之以上。微量可调移液器。微量带滤芯吸嘴。研钵。离心管。光学反应管。试剂试剂级别除另有规定，本方法试验用水应符合规定的级水，所用化学试剂均为分析纯。引物与探针采用无酶无酶水将每条引物与探针序列见表配制成储存液，置或更低温度冻存使用时取适量配制成工作液，避免多次冻融。配方。
8、见。柠檬酸钠缓冲液配方见。配方见。柠檬酸钠磷酸缓冲液配方见。氢氧化钠溶液配方见。硫酸溶液配方见。柠檬酸钠磷酸缓冲液配方见。氢氧化钠溶液配方见。硫酸溶液配方见提取液含蛋白酶。也可采用等效商品化试剂。灭菌双蒸水。氯甲烷。异丙醇。无水乙醇。乙醇用新开启的灭菌双蒸水配制，预冷。荧光反应缓冲液含。，甲基亚砜，甘油。可采用等效商品化试剂。和。酶。酶。生物安全要求采样样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守的有关规定。采样样品采集细菌培养物直接取液体培养基培养的菌液对于在固体培养基上生长的菌落，用接种棒挑取适量取用量达到肉眼可见，菌团大小不超过接种环菌样，放到理。反应体系中包括对用于扩增的引物，和条能与产物特异杂交的荧光标记探针。探针的端标记了被称为报告基团的荧光素，端。
9、，溶于蒸馏水中，定容至。结核病病原菌实时荧光检测方法。粪样前处理取粪样，按的比例加入硫酸溶液例如粪样，加液体充分振荡混匀，室温静置取上层约液体避免吸取粗渣，离心，取上清，离心!弃上清，加等量，振荡混匀，使沉淀充分悬浮，离心，弃上清，重复本步骤次收集沉淀物，继续进行核酸提和国国家标准结核病病原茵实时荧光检测方法发布实施宰瞀鹊鬻瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会仅刖吾本标准按照给出的规则起草。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位中华人民共和国广东出入境检验检疫局华中农业大学中国检验检疫科学研究院北京盈思科技发展有限公司。本标准主要起草人陈茹刘中勇杨国海郭爱珍曾碧健韩雪清高小博林祥梅吴晓薇。范围结核病病原菌实时荧光检测方法本标准规定了结核分。
10、续进行核酸提取，或置贮存备用。取出荧光反应缓冲液等试剂，室温融化酶酶除外，瞬清，用无菌注射器或真空采血管，无菌自动物静脉采血，将血液直接滴人抗凝剂中，并立即连续摇动，充分混合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液，或。每血液加抗凝剂。条件允许时，建议优先采集全血，以更有利于富集菌体。奶样无菌采集奶液于灭菌的容器中。般以后段奶液含菌量较多，早晨挤出的奶液含菌量最高。痰液动物痰液采集动物咯痰极少，宜在清晨采集，用橡胶管自口腔伸人至气管内，外接注射器吸取痰液。亦可取咳出的痰块。人痰液采集采集清晨从肺深处咳出的痰液。用灭菌容器密闭送检。组织器官采集动物下颌咽后支气管肺特别是肺门及肺门淋巴结纵隔和肠系膜淋巴结，以及病变组织器官如肝睥肺等。粪便采集混有粘液血液粘膜的粪便，或用刮匙从。
11、，或置贮存备用。组织器官前处理取适量组织样品剔除脂肪被膜，剪碎，按的比例加入柠檬酸钠磷酸缓冲液例如，组织样品，加入缓冲液，充分研磨加等量氢氧化钠溶液，继续研磨，使组织液化移人离心管，充分振荡，温浴取上清避免吸取粗渣，离心弃上清，加等量，振荡混匀，使沉淀充分悬浮，离心，弃上清，重复本步骤次收集沉淀物，继续进行核配方见提取液含蛋白酶。也可采用等效商品化试剂。灭菌双蒸水。氯甲烷。异丙醇。无水乙醇。乙醇用新开启的灭菌双蒸水配制，预冷。荧光反应缓冲液含。，甲基亚砜，甘油。可采用等效商品化试剂。和。酶。酶。生物安全要求采样样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守的有关规定。采样样品采集细菌培养物直接取液体培养基培养的菌液对于在固体培养基上生长的菌落，用接种棒挑取适量取。
12、记了淬灭基团。在进行延伸反应时，酶的外切酶活性将端荧光基团从探针上切割下来，使其与淬灭基团分离，从而仪器能检测到端荧光基团所发出的荧光信号，分子扩增产物的生成伴随分子荧光信号的产生。随着扩增循环次数的增加，仪器检测判的荧光信号的累积反应了扩增产物量的变化。本标准提供特异检测结核分枝杆菌复合群结核分枝杆菌和牛分枝杆菌共套实时荧光检测方法见表。其中，结核分枝杆菌复合群特异的实时荧光方法分别以插入基因序列为模板设计特异扩增引物与探针结核分枝杆菌牛分枝杆菌特异的实时荧光方法分别以菌种特异的基因组序列为模板设计特异扩增引物与探针。表荧光引物与探针序列类别核酸序列上游发布实施宰瞀鹊鬻瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会仅刖吾本标准按照给出的规则起草。本标准由全国动物防。
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