我的同学程文悦勒晶晶毛金春曹茂超魏泰唯帅伟龙沈鹏伍华贤胡斌，感谢他们直来给予我帮助和关心,感谢多年如日支持我求学的父母，有他们的理解与大力支持才使我得以全神贯注地投入学习和研究。感谢所有直鼓励和支持我的家人和朋友。感谢江西省水产科学研究所为本研究提供实验用鱼。最后再次向我的导师，以及帮助过我的老师同学朋友，我的家人，致以最崇高的敬意和最衷心的感谢,胡乐华年月要途径。双链在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制的变性和复性，并设计引物做启动子，加入聚合酶就可以完成特定基因的体外复制。标准的过程分为三步变性双链模板在热作用下，氢键断裂，形成单链退火复性系统温度降低，引物与模板结合，形成局部双链。延伸在酶在左右最佳的活性的作用下，以为原料，从引物的端端延伸，合成与模板互补的链。每循环经过变性退火和延伸，含量既增加倍。如图所示图的反应过程图解，的诱导作用为异丙基硫代半乳糖苷，是种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用其诱导原理是的乳糖操纵子元含及三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶透酶和乙酰基转移酶，此外还有个操纵序列个启动序列及个调节基因图。基因编码种阻遏蛋白，后者与序列结合，使操纵子元受阻遏而处于关闭状态。在启动序列上游还有个分解代谢物基因激活蛋白结合位点。由序列序列和结合位点共同构成操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同调控区调节，实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时，操纵子元处于阻遏状态。此时，序列在启动序列操纵下表达的阻遏蛋白与序列结合，阻碍聚合酶与序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，操纵子元即可被诱导。在这个操纵子元体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与序列解离发生转录。异丙基硫代半乳糖苷是种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。本论文的研究目的和意义是由干扰素诱导的最重要的抗病毒蛋白之，能抑制细胞和病毒蛋白的合成，参与构成细胞抗病毒的第道防线。该基因编码的蛋白端没有典型的区域，取而代之的是两个结合区域。而首先在中得到鉴定，也就是说同时具有哺乳类干扰素系统中两种重要的效应蛋白和结构特征。所以对，特别对其进行研究有着重要的理论意义。第二章材料和方法实验材料主要仪器和设备高速冷冻离心机小型台式离心机定量移液器，公司台式冷冻离心机公司恒温水浴锅低温水浴锅北京科学仪器厂恒温摇床江苏金壇电子公司脱色摇床江苏海门医用仪器厂恒温恒压垂直电泳仪北京市六仪器厂恒温生化培养箱超净工作台苏州净化设备有限公司超声波破碎仪公司分析天平电子天平梅特勒托利多仪器上海有限公司转膜仪振荡器高温烘箱上海智诚分析仪器制造有限公司微波炉格兰仕主要试剂琼脂糖甘氨酸丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺咪唑考马斯亮蓝胰蛋白胨酵母粉公司巯基乙醇公司抑肽酶琼脂粉针头式滤器公司透析袋美国公司其它试剂均为国产分析纯。实验材料实验用的草鱼草鱼尾，由江西省水产科学研究所提供。鲫鱼全长文库。实验方法草鱼克隆载体的构建引物设计系列分析表明，草鱼基因序列与鲫鱼的基因序列具有极高的同源性，根据已知的鲫鱼全长序列，设计引物上游引物下游引物草鱼基因的克隆利用上面的引物从鲫鱼全长文库扩增目的基因片段。反应体系如下全长文库模板，上下游引物各，总体积。反应条件为预变性，变性，退火，延伸，个循环，加尾。目的基因连接载体将产物直接连接到载体。连接反应体系为，质粒，连接酶，产物，于连接过夜。连接产物的转化与鉴定挑大肠杆菌的单菌落于液体培养基中，培养过夜取出菌液转移到个装有液体培养基的三角瓶中，摇床上转分培养至对数生长期约分装入四个的离心管中，冰浴，离心沉淀细胞用冰预冷的重悬细胞，离心沉淀细胞用冰预冷的重悬细胞，并将四管细胞转移到个管中，使最后细胞的总体积为，即为感受态细胞。冰箱中保存备用，也可将感受态细胞用的无菌甘油稀释后置于较长时间保存取感受态细胞，加入连接产物，在个的管中混匀，冰浴热休克，迅速在冰浴中加入液体培养基转分摇动培养离心，沉淀细胞，去除培养基混匀细胞，涂平板含，培养以上挑克隆，筛选重组克隆，并经双酶切验证。草鱼原核表达载体的构建质粒的提取与酶切将筛选的阳性克隆小量培养，用质粒小量纯化试剂盒提取质粒步骤见试剂盒操作手册。将质粒和原核表达载体进行双酶切。酶切反应体系为无菌水，基因经多克隆位点插入后，可与基因起融合表达，融合表达不仅提高了表达产物的稳定性，而且由于相对分子质量增大，用更容易分析鉴定。同时通过个组氨酸残基更容易分离提纯。此外，外源蛋白与硫氧还蛋白之间具有肠激酶和凝血酶的识别位点，从而也方便了外源蛋白与硫氧还蛋白的分离。参考文献胡成钰鲫鱼基因的鉴定及其特征分析中国科学院理学博士学位论文吴初新鱼类与的结合南昌大学博士学位论文彭悟在鲫鱼和草鱼组织中的表达特性分析南昌大学硕士学位论文谢宗波鲫鱼结构域的表达及其与核酸亲和性分析南昌大学硕士学位论文汤雅男在草鱼组织中表达及原子力显微镜观察结合重组质粒南昌大学硕士学位论文汤雅男，杨攀，胡成钰及其生物学功能生命科学，时俊华陶敏许丹胡成钰结合蛋白与结构域生命的化学杨攀鲫鱼结构域与重组质粒的亲和性南昌大学理学硕士学位论文吴初新林刚胡成钰鱼类激酶和生命的化学，季德华草鱼养殖方法及综合并发症的诊治养殖技术顾问，宋迁红草鱼生长对照试验初探科学养鱼严成其阮辉辉水稻抗白叶枯病基因的鉴定定位和克隆宁波农业科技年第期李利斌徐寿春刘立峰李化银陈伟高建伟大白菜两个基因的鉴定山东农业科学倪振亚焦新安高崧彭大新张如宽刘秀梵大肠杆菌猪水肿毒素亚单位基因的克隆与鉴定生物技术学报詹梓金武夷大红袍种源追溯与基因鉴定福建农林大学，，，黄培堂，等译分子克隆实验指南北京科学出版社王伟，孙永华，汪亚平，等草鱼生长激素在毕赤酵母中的高效分泌表达遗传学报王莉克隆与表达草鱼干扰素基因及其抗弹状病毒效果的研究中国农业大学硕士学位论文张义兵，张奇亚，徐德全，等从灭活病毒诱导的培养细胞中鉴定鱼类抗病毒相关基因科学通报，，，，，，，致谢首先向我的导师范丽华老师表示最诚挚的敬意和最衷心的感谢,本文至始至终都是在导师范丽华老师的悉心指导下完成的，从论文选题设计实施直至最后的文稿审订，质粒或载体，酶切。醉切产物的回收酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下目的带，并回收具体操作见。目的基因连接载体将经双酶切并纯化的目的基因片段分别连接载体和载体，构建原核表达载体。连接反应体系载体，目的基因，缓冲液含连接酶，过夜。连接产物的转化与鉴定将连接产物转化至大肠杆菌，筛选阳性克隆，并通过原核表达验证两载体的表达效果，取表达效果好的进行测序验证重组克隆。原核表达取测序正确的阳性克隆菌液接种于液体培养基中，振荡培养当时，分出菌液作对照，其余的菌液中加入以终浓度为诱导，继续培养取空白和经诱导的菌液各，离心收集菌体，沉淀加上样缓冲液并煮沸变性，稍离心，上清用于电泳。表达产物的纯化菌液经诱导培养后离心，小心倾掉上清，用重悬沉淀将离心管置于冰水浴中，超声波破碎，直至液体不再粘稠。为防止温度过高，冷却和超声波破碎要间隔进行，离心，去除残渣，上清经亲和层析柱纯化操作见操作手册过柱后的蛋白组分在透析缓冲液甘油，中透析过夜，保存备用。法测定蛋白质浓度在酸性条件下，考马斯亮蓝和蛋白质结合产生特殊的蓝色，最大吸收波长在处。与其他蛋白浓度测定方法如法相比，该方法不受样品中化学物质的影响。测定范围为。在此范围内，蛋白定量最为准确。标准曲线的测定及样品的测定方法参照绘制蛋白浓度标准曲线。按下表配置蛋白标准液。表法之蛋白标准液的相对吸光度测定管号双蒸水蛋白标准液稀释液说明号试管不加蛋白质，作为空白对照号试管分别加入标准蛋白浓度的，以测定下吸光度，绘制蛋白浓度标准曲线。稀释液为纯化蛋白的溶剂。管为待测样品稀释液，测定下吸光度，对照标准曲线得出蛋白浓度。第三章实验结果草鱼基因的克隆以和为上下游引物，从全长文库中扩增目的基因，产物进行琼脂糖凝胶电泳。得图草鱼结构城克隆原核表达与纯化测序正确的菌株经诱导表达，离心收集菌体沉淀，加上样缓冲液并煮沸，进行电泳。与对照组相比，诱导效果很明显。表达产物融合多肽带有标签，因此经树脂进行亲和层析纯化后，如图所示，纯化效果较好，纯化的产物经透析后保存备用。图融合多肽的纯化蛋白质浓度的测定标准蛋白浓度测定如表，根据测定在工作表中绘制标准曲线，以吸光度为横坐标，反应蛋白浓度为纵坐标，回归出线性方程和线性相关系数图，根据线性方程计算待测样品的反应蛋白浓度值为。表浓度测定法管号平均值吸光度浓度说明考马斯亮蓝法测定标准浓度，和号管在吸光度利用绘制标准曲线测定三管未知浓度蛋白质样品德号管，根据标准曲线得出蛋白质样品的浓度。图考马斯凫蓝法测定标准浓度的吸光度的旅度分别为和。第四章讨论表达载体的选择大肠杆