④即沙红染色用于组织学评分，评分方法按法电镜下观察软骨细胞内结构形态变化及其周围胶原纤维的变化。在细胞培养的相关检测中，我们采用法检测软骨细胞的增殖能力，用全自动生化分析仪对检测总蛋白含量，使用细胞流式仪进行细胞凋亡的测定，对含量的测定则使用分型试剂盒和试剂盒。目标达到的主要技术指标或技术经济指标技术特征及创新之处。现代科学技术与中医药理论相结合，深入研究中医药治疗的作用机制，为临床应用提供更加科学有利的客观依据，发挥中医药治疗的特色和优势，为临床常见严重影响人类健康的研究出有效安全便于推广应用的中医药治疗方法，使能迅速缓解症状，大大减轻病人痛苦，降低膝骨关节炎的致残率和复发率，且副作用小的简便廉验的中药制剂问世。治疗膝的新药生产及对其在治疗中所起作用机制的深入探讨，既符合国情又能够走向世界，产生较大的社会和经济效益，这必然形成高新技术产业进入高新领域，对促进科技进步，发展中医药，有着积极的作用，同时这也是中药现代化研究的发展方向和新的探索。实验研究方法及技术路线。对实验性大鼠骨性关节炎的防治作用模型的制备取雄性大鼠只，体重，固定，常规备皮消毒，沿髌韧带内侧缘切口，切断双后肢内侧副韧带及膝前内侧筋膜扩张部，并在断端处修剪去除约，造成双后肢膝外翻畸形。术后第二天放造模大鼠于拖箱内每天赶其行走。取雄性大鼠只，体重，木瓜蛋白酶溶液与半胱氨酸溶液混置小时后，分别在第天于实验大鼠膝关节腔内注入混合液。方法将造模后的大鼠随机分为模型组阳性对照组维骨力组治疗组，另设正常对照组，分别灌胃给药或蒸馏水，连续周。七周后将动物麻醉后，立即将大鼠以仰卧位固定，颈总取血，接入试管中，离心获取含药血清切开关节囊，进行大体观察后，然后以锐利刀片切取膝关节前正中部分的滑膜组织，作染色，电镜下观察。再用锐利刀片切取股骨内倮软骨使其呈全层软骨标本，戊二醛溶液固定，电镜下观察。所余之股骨内倮连同软骨下骨并切下，福尔马林溶液固定小时以上，分别作沙红及三色染色后光镜检查，取样后即可将动物处死。观察指标大体肉眼观察软骨及滑膜表面情况染色观察有关的形态变化三色染色观察胶原的变化④即沙红染色用于组织学评分，评分方法按法附评分等级表如下电镜下观察软骨细胞内结构形态变化及其周围胶原纤维的变化。评分等级Ⅰ结构正常表面结构微小不规则表面结构中等不规则表面结构严重不规则过渡层出现裂隙辐射层出现裂隙钙化层出现裂隙过渡层消失辐射层消失钙化层消失结构完全破坏Ⅱ细胞切线的区域正常细胞肿胀细胞消失过渡和辐射的区域少量的细胞增多中等量的细胞增多大量的细胞增多少量的克隆中等量的克隆大量的克隆少量的细胞减少中等量的细胞减少大量的细胞减少细胞消失Ⅲ变异标记完整多层模糊血管的交叉Ⅳ血管翳形成没有少量中等量大量对体外培养兔膝关节软骨细胞的影响兔膝软骨细胞的原代培养无菌条件下取两周龄新西兰白兔后肢关节，用刀片取关节表面软骨，收集在含磷酸缓冲液的无菌小培养皿内，反复清洗除去软骨片表面的血液，以及可能勿带之滑膜组织。漂洗完毕后，用无菌的眼科小剪刀在培养皿中将其细切至不大于。切碎后将其装入试管内，按量加入消化酶类进行化学解离。先用胰酶消化，然后去除胰酶，加入胶原酶Ⅱ消化小时后，离心，弃上清，加入，摇匀在同上离心弃上清，在加反复三次，最后次加含胎牛血清培养液，用吸管轻轻吹打均匀，目筛网过滤，放入培养瓶中，培养箱培养，定期换液，并观察照相，长满后用胰酶消化传代。分三个阶段实施。第阶段调研及资料检索，准备阶段并上报待批。第二阶段完成全部实验工作。第三阶段资料汇总总结处理数据分析与研究成果撰写论文上报鉴定鉴定后申报成果。经费预算检索调研研制药物检查费购买特殊试剂盒打字复印约万。动物实验药理毒理细胞培养材料约万。总计万主要研究人员姓名性别年龄单位专业职务在本项目中的主要工作朱萱萱女江苏省中医院药学主任药师课题负责人董朝岚女南京中医药大学药学药理毒理刘丽敏女南京中医药大学药学药理毒理闻国兰女江苏省中医院动物饲养软骨细胞增殖反应的作用将在培养瓶中长满的细胞消化，接入孔培养板中，孔，待细胞长成单层后，将旧液弃去，用轻轻荡洗遍，然后加入含药血清，孔，每组个复孔。二氧化碳恒温培养箱孵育后，取上清液。每孔加入试剂既无血清培养液，再孵育。取上清，每孔加入溶甲瓒液，以主波长，参比波长于酶标仪上比色，读取吸光度值。对软骨细胞的细胞凋亡的影响单层细胞培养板制作同上，加入含药血清，每组个复孔，于培养箱中培养，弃去旧液，用胰酶消化待细胞有变圆趋势即取出消化液，加入，用吸管轻轻吹打，使成单个细胞悬液，移入离心管离心，去掉上清液，约留细胞悬液，用振荡器使细胞分散，用细滴管或注射器将细胞迅速注入冷乙醇中乙醇终浓度为，用细胞流式仪检测凋亡细胞数目，计算凋亡百分率。对软骨细胞蛋白合成和含量的影响同样将各组含药血清加入已长成单层细胞的培养板内，恒温培养箱培养后，收集上清液，用全自动生化分析仪检测总蛋白含量，用分型试剂盒和试剂盒检测各组含量。拆方后对软骨细胞的影响进行拆方实验，筛选出补肝肾组方祛风湿组方和化瘀痰组方三组，对这三组及复方分别进行体外的软骨细胞实验，设立阳性对照组维骨力组细胞毒性实验将各组方药液用培养基分别配成几个待测浓度，加入已长成单层细胞的培养板内，分别观察细胞形态的变化，选择细胞不发生变圆萎缩漂浮的最大浓度为药物对细胞的最大无毒浓度，以便继续实验。对软骨细胞的细胞凋亡增殖含量及基因表达的影响将各组方药液分别配置成最大无毒浓度，加入已长成单层软骨细胞的细胞培养板内，具体检测操作则同加入含药血清的实验。现有工作条件和基本条件本课题主要承担者是江苏省中医院临床医学研究所。本所具有江苏省科学技术委员会，江苏省标准局颁布的动物饲育环境合格证书，动物质量合格证书，人员素质高，均拥有实验动物从业人员岗位证书。仪器设备先进完善，拥有无菌室，能够进行细胞培养及指标检测等系列工作，具有较强的科研能力。本组方的提供者是本院的风湿科，该科拥有专科病房张病床及全天专科门诊，同时还开展了专病门诊包括，技术力量较强，技术水平较高，在省内外中西医风湿界均有定的影响。本课题负责人朱萱萱主任药师，副教授，是省药理学会理事中华中医药学会制剂分会委员。主要从事中药药理，毒理和中药制剂的研究工作。养阴生肌膜治疗口腔溃疡的临床及实验研究获省中医药科技进步等奖排名第保精片治疗前列腺炎的实验研究获省中医药科技进步二等奖排名第中医治疗原发性视网膜色素变性临床及机理研究获省中医药科技进步等奖排名第小儿退热滴肠液的临床研究获省中医药科技进步二等奖排名第洋金花伤膏获省中医药科技进步二等奖排名第克乳痛治疗乳腺炎的临床及机理研究获省政府二等奖排名第津血源治疗干燥综合症的临床及实验获省政府三等奖排名第宫颈宁治疗宫颈炎的临床及实验研究获省中医药科技进步二等奖排名第养心托毒颗粒剂治疗病毒性心肌炎的临床机理研究获省政府三等奖排名第血康糖浆治疗小儿贫血的临床和实验研究获市科技进步三等奖排名第中药缓释口腔粘附片的研制获市科技进步三等奖排名第。通过成果鉴定项目有病毒清眼膜的研制消症饮治疗子宫内膜异位症临床和实验研究强心合剂治疗心衰的临床及实验研究病窦灵治疗窦房结综合症临床及实验研究乌鳖口服液治疗卵巢功能早衰的实验研究益肾健脾颗粒剂治疗青春期功血的临床和实验研究四通颗粒剂与紫外线照射充氧自血回输结合治疗急性缺血性中风的临床及机理研究热痹消治疗急性痛风性关节炎的研究从脾肺论治免疫性溃疡性结肠炎的临床和实验研究大黄蛰虫丸对阿霉素肾病伴高血脂症大鼠的实验研究滋阴抑元颗粒对免疫性不孕的机理研究脑血通对急性出血性脑中风的实验研究茱萸颗粒对病毒性心肌炎免疫损伤作用的研究。完成新药基金的药效学和毒理学研究项，其中项为计划，编号，排名第项为口腔膜的研制省中管局排名第项为薤白胶囊的研制，省科委高新开发项目，排名第。近年来发表论文篇，其中国家级刊物篇第作者篇，省级刊物篇第作者篇。现阶段我们已完成了部分痛痹颗粒机理的实验研究，其中包括该方抗炎镇痛作用抗氧化作用及改善血液微循环等方面系列的实验工作，同时我们也进行了些预实验，包括对模型的复制等。已有以下主要仪器设备，可满足本项研究使用。超低温冰箱日本三洋公司倒置显微镜日本公司紫外分光光度计上海分析仪器总厂低温高速离心机德国公司蛋白核酸分析仪美国公司仪美国公司孔酶标仪美国公司紫外线检测仪上海长兴机械厂荧光定量分析仪美国公司电子天平上海天平厂净化工作台苏州净化设备厂恒温培养箱德国贺利氏公司欠缺的有细胞流式仪计划进度总研究期限年元九研究人员姓名单位性别出生年月专业专业技术职务承担工作签章项目主要负责人参加项目研究人员十承担单位审查及承诺意见盖章第承担单位第二承担单位法人签字法人签字盖章盖章年月日年月日十协作单位及审查承诺意见盖章法人签字盖章年月日十二项目主管部门审查承诺意见盖章盖章年月日登记序号项目编号中医药中西医结合科研项目课题设计书课题名称痛痹颗粒对骨关节炎细胞凋亡和增殖的机理研究申报单位江苏省中医院课题负责人朱萱萱计划年限邮政编码联系电话申报日期江苏省中医药局制填写提纲立项依据与选题直接相关的国内外现状水平和发展趋势选题的理论和实践依据研究目的意义本研究达到的科学技术水平，预期社会经济效益和应用推广前景。二科研假说或技术构思，主要研究内容关键技术目标达到的主要技术指标或技术经济指标，技术特征及创新之处，开发项目应说明开发规模。三研究试验方法及技术路线工艺路线。四现有工作条件和基础开展本项研究的技术优势，现有的主要仪器设备及应用合格实验动物的基本条件等已有工作基础，预试验情况。五计划进度根据总的研究期限年度计划进度，分别列出具体的目标和进度的考核指标。六参加协作单位意见及具体分工附协议书。七经费概算包括其他部门的拨款贷款自筹记忆取得的自主和核算依据，以及分年度使用计划。填写说明内容填写自备附页，用纸大小和封页致，字迹清楚，装订整齐后按申报要求上报。二填写提纲所列内容，要全面详细如实填写。三封面上登记序号项目编号请勿填写。立项依据研究目的意义骨关节炎，又称退行性关节病，以关节软骨发生弥漫性龟裂纤维化和脱失及因骨组织增生性变化为特征的组临床征候群，是多见于中年以后的慢性进行性关节疾患。该病发病率随年龄增长而升高，据调查，在美国目前亿多人口中，就有骨关节炎万，发病率占总人口的，在老年人中所占比例更高，岁以上人群中，的患病率仅次于心血管疾病，位居第二位。在我国，根据流行病学调查显示，岁的人群中发病率达，而岁以上人群的患病率达。随着计划生育政策的长久实施及经济发展，我国已进入老龄化社会，的发病率还将越来越高，这不仅严重危害人民的生活健康，对社会也将造成很大负担。同时世界其他国家也面临着同样的问题，因而引起了国际国内医学界的相当重视。近年来对的研究颇多，在发病机制检测手段以及治疗方法上均取得较大进步，但总的来说还缺乏令人满意的突破性进展。西药治疗的主要