模型及最新的国际公认的相关指标进行实验研究，观察其对的确切疗效及作用机理，这必将对的中医理论产生较大影响，同时对临床治疗也起到更好的指导作用，从而产生较好的社会经济效益。随着改革开放的形势发展，以及中国加入与国际接轨的进程的不断完善，祖国医学国际地位不断的提高，我们将从祖国医学宝库中发掘出的治疗的高效药物与现代新技术新方法进行研究总结，从而为人类造福，为振兴中医事业做出应有的贡献。科研假说或技术构想主要内容技术关键目的，技术特征及创新之处，开发项目应说明开发规模。主要内容探讨的病因病机，提出新见解，发展中医理论。运用现代科学技术，开展实验研究，从分子生物学免疫学生理生化学等多方面来探讨痛痹颗粒治疗膝的疗效机制及药理毒理作用。主要技术关键膝模型的复制目前所使用的动物模型般可分为两大类，其是诱发模型，即通过各种操作方法如制动手术关节内注药关节内植入软骨碎片或微粒等诱导产生另类为自发模型，即不用任何外界干预，动物自发，如黑鼠等。在选择动物模型时般应考虑动物的种属包括其生活习性关节结构组织学及病理学特征不同方法的造模机制和模型的特点，并应参照研究目的加以选择。在诱发模型中，常用的方法是手术造成关节的应力改变及关节腔内注入木瓜蛋白酶，这两种方法都能复制出较成功较高的模型，且操作较为简单。具体的造模机制在于低应力可以造成软骨厚度减少，染色变淡，水分增加，蛋白聚糖聚集度损伤等变化，木瓜蛋白酶作为种蛋白水解酶会引起关节软骨的退行性改变。在具体的造模过程中我们选用以上两种方法来分别复制动物模型。用于动物模型的动物般有狗兔鼠等，我们选用大鼠做模型，因为该模型关节软骨退变的组织学特征与人类相似，且动物来源较广泛，且经济。关节软骨细胞的获取和培养基于来源广泛，操作可行的原则，目前用于体外培养的软骨细胞般均为兔关节软骨细胞原代培养所得。软骨需在严格无菌的条件下分离，经过系列的漂洗消化等工作后获取软骨细胞。目前还没有专门用于软骨细胞培养的培养液，国外采用的培养液种类繁多，有改良等，国内的有高糖等，其中加入胎牛血清占，般以使用培养液居多。在培养液中还含有些辅助添加剂，包括丙酮酸钠谷氨酰胺二硫基乙醇以及万单位的青霉素和万单位的链霉素，。培养过程中般使用的恒温培养箱。采用的检测手段及指标在病理组织形态学的检查中，般采用以下几个观察指标大体肉眼观察软骨及滑膜表面情况染色观察有关的形态变化三色染色观察胶原的变化④即沙红染色用于组织学评分，评分方法按法电镜下观察软骨细胞内结构形态变化及其周围胶原纤维的变化。在细胞培养的相关检测中，我们采用法检测软骨细胞的增殖能力，用全自动生化分析仪对检测总蛋白含量，使用细胞流式仪进行细胞凋亡的测定，对含量的测定则使用分型试剂盒和试剂盒。目标达到的主要技术指标或技术经济指标技术特征及创新之处。现代科学技术与中医药理论相结合，深入研究中医药治疗的作用机制，为临床应用提供更加科学有利的客观依据，发挥中医药治疗的特色和优势，为临床常见严重影响人类健康的研究出有效安全便于推广应用的中医药治疗方法，使能迅速缓解症状，大大减轻病人痛苦，降低膝骨关节炎的致残率和复发率，且副作用小的简便廉验的中药制剂问世。治疗膝的新药生产及对其在治疗中所起作用机制的深入探讨，既符合国情又能够走向世界，产生较大的社会和经济效益，这必然形成高新技术产业进入高新领域，对促进科技进步，发展中医药，有着积极的作用，同时这也是中药现代化研究的发展方向和新的探索。实验研究方法及技术路线。对实验性大鼠骨性关节炎的防治作用模型的制备取雄性大鼠只，体重，固定，常规备皮消毒，沿髌韧带内侧缘切口，切断双后肢内侧副韧带及膝前内侧筋膜扩张部，并在断端处修剪去除约，造成双后肢膝外翻畸形。术后第二天放造模大鼠于拖箱内每天赶其行走。取雄性大鼠只，体重，木瓜蛋白酶溶液与半胱氨酸溶液混置小时后，分别在第天于实验大鼠膝关节腔内注入混合液。方法将造模后的大鼠随机分为模型组阳性对照组维骨力组治疗组，另设正常对照组，分别灌胃给药或蒸馏水，连续周。七周后将动物麻醉后，立即将大鼠以仰卧位固定，颈总取血，接入试管中，离心获取含药血清切开关节囊，进行大体观察后，然后以锐利刀片切取膝关节前正中部分的滑膜组织，作染色，电镜下观察。再用锐利刀片切取股骨内倮软骨使其呈全层软骨标本，戊二醛溶液固定，电镜下观察。所余之股骨内倮连同软骨下骨并切下，福尔马林溶液固定小时以上，分别作沙红及三色染色后光镜检查，取样后即可将动物处死。观察指标大体肉眼观察软疗急性缺血性中风的临床及机理研究热痹消治疗急性痛风性关节炎的研究从脾肺论治免疫性溃疡性结肠炎的临床和实验研究大黄蛰虫丸对阿霉素肾病伴高血脂症大鼠的实验研究滋阴抑元颗粒对免疫性不孕的机理研究脑血通对急性出血性脑中风的实验研究茱萸颗粒对病毒性心肌炎免疫损伤作用的研究。完成新药基金的药效学和毒理学研究项，其中项为计划，编号，排名第项为口腔膜的研制省中管局排名第项为薤白胶囊的研制，省科委高新开发项目，排名第。近年来发表论文篇，其中国家级刊物篇第作者篇，省级刊物篇第作者篇。现阶段我们已完成了部分痛痹颗粒机理的实验研究，其中包括该方抗炎镇痛作用抗氧化作用及改善血液微循环等方面系列的实验工作，同时我们也进行了些预实验，包括对模型的复制等。已有以下主要仪器设备，可满足本项研究使用。超低温冰箱日本三洋公司倒置显微镜日本公司紫外分光光度计上海分析仪器总厂低温高速离心机德国公司蛋白核酸分析仪美国公司仪美国公司孔酶标仪美国公司紫外线检测仪上海长兴机械厂荧光定量分析仪美国公司电子天平上海天平厂净化工作台苏州净化设备厂恒温培养箱德国贺利氏公司欠缺的有细胞流式仪计划进度总研究期限年分三个阶段实施。第阶段调研及资料检索，准备阶段并上报待批。第二阶段完成全部实验工作。第三阶段资料汇总总结处理数据分析与研究成果撰写论文上报鉴定鉴定后申报成果。经费预算检索调研研制药物检查费购买特殊试剂盒打字复印约万。动物实验药理毒理细胞培养材料约万。总计万主要研究人员姓名性别年龄单位专业职务在本项目中的主要工作朱萱萱女江苏省中医院药学主任药师课题负责人董朝岚女南京中医药大学药学药理毒理刘丽敏女南京中医药大学药学药理毒理闻国兰女江苏省中医院动物饲养骨及滑膜表面情况染色观察有关的形态变化三色染色观察胶原的变化④即沙红染色用于组织学评分，评分方法按法附评分等级表如下电镜下观察软骨细胞内结构形态变化及其周围胶原纤维的变化。评分等级Ⅰ结构正常表面结构微小不规则表面结构中等不规则表面结构严重不规则过渡层出现裂隙辐射层出现裂隙钙化层出现裂隙过渡层消失辐射层消失钙化层消失结构完全破坏Ⅱ细胞切线的区域正常细胞肿胀细胞消失过渡和辐射的区域正常少量的细胞增多中等量的细胞增多大量的细胞增多少量的克隆中等量的克隆大量的克隆少量的细胞减少中等量的细胞减少大量的细胞减少细胞消失Ⅲ变异标记完整多层模糊血管的交叉Ⅳ血管翳形成没有少量中等量大量对体外培养兔膝关节软骨细胞的影响兔膝软骨细胞的原代培养无菌条件下取两周龄新西兰白兔后肢关节，用刀片取关节表面软骨，收集在含磷酸缓冲液的无菌小培养皿内，反复清洗除去软骨片表面的血液，以及可能勿带之滑膜组织。漂洗完毕后，用无菌的眼科小剪刀在培养皿中将其细切至不大于。切碎后将其装入试管内，按量加入消化酶类进行化学解离。先用胰酶消化，然后去除胰酶，加入胶原酶Ⅱ消化小时后，离心，弃上清，加入，摇匀在同上离心弃上清，在加反复三次，最后次加含胎牛血清培养液，用吸管轻轻吹打均匀，目筛网过滤，放入培养瓶中，培养箱培养，定期换液，并观察照相，长满后用胰酶消化传代。对软骨细胞增殖反应的作用将在培养瓶中长满的细胞消化，接入孔培养板中，孔，待细胞长成单层后，将旧液弃去，用轻轻荡洗遍，然后加入含药血清，孔，每组个复孔。二氧化碳恒温培养箱孵育后，取上清液。每孔加入试剂既无血清培养液，再孵育。取上清，每孔加入溶甲瓒液，以主波长，参比波长于酶标仪上比色，读取吸光度值。对软骨细胞的细胞凋亡的影响单层细胞培养板制作同上，加入含药血清，每组个复孔，于培养箱中培养，弃去旧液，用胰酶消化待细胞有变圆趋势即取出消化液，加入，用吸管轻轻吹打，使成单个细胞悬液，移入离心管离心，去掉上清液，约留细胞悬液，用振荡器使细胞分散，用细滴管或注射器将细胞迅速注入冷乙醇中乙醇终浓度为，用细胞流式仪检测凋亡细胞数目，计算凋亡百分率。对软骨细胞蛋白合成和含量的影响同样将各组含药血清加入已长成单层细胞的培养板内，恒温培养箱培养后，收集上清液，用全自动生化分析仪检测总蛋白含量，用分型试剂盒和试剂盒检测各组含量。拆方后对软骨细胞的影响进行拆方实验，筛选出补肝肾组方祛风湿组方和化瘀痰组方三组，对这三组及复方分别进行体外的软骨细胞实验，设立阳性对照组维骨力组细胞毒性实验将各组方药液用培养基分别配成几个待测浓度，加入已长成单层细胞的培养板内，分别观察细胞形态的变化，选择细胞不发生变圆萎缩漂浮的最大浓度为药物对细胞的最大无毒浓度，以便继续实验。对软骨细胞的细胞凋亡增殖含量及基因表达的影响将各组方药液分别配置成最大无毒浓度，加入已长成单层软骨细胞的细胞培养板内，具体检测操作则同加入含药血清的实验。现有工作条件和基本条件本课题主要承担者是江苏省中医院临床医学研究所。本所具有江苏省科学技术委员会，江苏省标准局颁布的动物饲育环境合格证书，动物质量合格证书，人员素质高，均拥有实验动物从业人员岗位证书。仪器设备先进完善，拥有无菌室，能够进行细胞培养及指标检测等系列工作，具有较强的科研能力。本组方的提供者是本院的风湿科，该