验研究方面也开始了向多层次多角度的方向发展。动物实验不再只局限于微循环和般抗炎镇痛试验，现已使用针对的动物实验，并采用相关的指标进行检测。目前实验研究内容主要有以下几个方面，研究最多的是的血液流变学氧自由基及氧化氮含量等，这些试验般均可通过建立骨关节炎的模型来完成，也可通过使用其它相似的模型检测相关指标来进行，如可建立急性血淤模型来检查血液流变学指标，使用老龄动物通过检测体内及含量推断药物的抗氧自由基的能力等。在对影响的实验中，般采用硝酸还原酶法来测定含量，运用技术测定基因表达。等细胞因子软骨降解酶尤其是基质金属蛋白酶诱导关节滑膜炎症的物质如纤溶酶原纤溶酶原激活物和前列腺素软骨细胞的细胞凋亡及增殖情况性激素水平等也越来越多地被作为检测指标使用到实验研究中来。选题的理论和实践依据祖国医学并无骨关节炎的病名，从历代文献来看本病应归属于骨痹痛痹范畴。我们认为病人除了肝肾亏虚，寒湿痹阻外，般病人体重超重较多，也即为痰湿偏盛之体，另外脾虚生湿及寒湿痹阻日久湿聚成痰，痰淤交阻是引起膝关节肿胀畸形活动受限的重要因素，所谓顽症怪病皆质之于痰淤。基于现代医学对发病机理的深入研究，我们在补益肝肾活血通络基础上，结合中药对缓解软骨降解，增加软骨细胞功能，抑制滑膜增生及炎症的研究成果，于年即对备急千金要方中的独活寄生汤进行化裁，重用活血化淤，加用化痰清热之品，总结制定出了高效药源广泛安全可行的痛痹颗粒，并于年采用痛痹颗粒的组方治疗膝，方中以独活为君药，以祛下焦与筋骨间风寒湿邪威灵仙舒筋通络止痹痛淫羊藿怀牛膝补肝肾，强筋骨，通经络，其中怀牛膝为引经药当归养血柔肝舒筋活血川芎则通达四肢关节，为血中气药虎杖活血清热解毒，同时防诸药辛燥太过。诸药合用共起补肝肾祛风湿化瘀痰之功，冀能消炎止痛，保护软骨。通过例的临床研究观察，结果表明本方疗效显著且副作用小。因此有必要对痛痹颗粒治疗骨性关节炎的作用机制尤其是该方对软骨细胞的细胞凋亡与增殖机理做进步的研究，冀能证实痛痹颗粒的临床疗效，明确其作用机制，并初步探讨本病发病的可能机理，为新药问世提供客观的依据，所以进行设计并立题。本研究达到的科学技术水平，预期社会效益和应用推广前景继承和发扬祖国医学，保持中医特色，以临床疗效为前提，以实验研究为基础，制造规范化大鼠的膝模型，从发病机理探讨本药的作用机制。本实验采用可靠地国际公认的方法复制动物模型，并采用最新的检测指标等，总之本研究基于现代医学对发病机制的最新研究成果，从生化免疫等多个角度多个层次，系统观察并进行归纳总结，确保本课题不但可行而且先进，冀能填补省内外运用中药治疗的空白，并希望以此为基础，进步从细胞水平包括本药对软骨细胞及细胞凋亡与增殖的影响研究中药对的长久作用及影响，从而达到挤身国际先进水平的目的，让中药真正走向世界。目前，中药治疗的方法颇多，但大多以临床疗效研究为主，大样本规范化的研究很少，中医中药治疗机理的研究，虽有涉及，但大多分散且存在定的重复性，理想的治疗药物尚未问世，具有公认疗效的小儿迁延性腹泻临床治疗方案尚未确立，其疗效评价体系尚需研究确定，尤其是缺少中医药治疗学整体研究思路与方法，使中药复方治疗的疗效机理尚未能全面揭示，影响了该领域研究的深入。而痛痹颗粒是在中医理论指导下选用千金要方中独活寄生汤进行加减所得，并采用可靠的实验模型及最新的国际公认的相关指标进行实验研究，观察其对的确切疗效及作用机理，这必将对的中医理论产生较大影响，同时对临床治疗也起到更好的指导作用，从而产生较好的社会经济效益。随着改革开放的形势发展，以及中国加入与国际接轨的进程的不断完善，祖国医学国际地位不断的提高，我们将从祖国医学宝库中发掘出的治疗的高效药物与现代新技术新方法进行研究总结，从而为人类造福，为振兴中医事业做出应有的贡献。科研假说或技术构想主要内容技术关键目的，技术特征及创新之处，开发项目应说明开发规模。主要内容探讨的病因病机，提出新见解，发展中医理论。运用现代科学技术，开展实验研究，从分子生物学免疫学生理生化学等多方面来探讨痛痹颗粒治疗膝的疗效机制及药理毒理作用。主要技术关键膝模型的复制目前所使用的动物模型般可分为两大类，其是诱发模型，即通过各种操作方法如制动手术关节内注药关节内植入软骨碎片或微粒等诱导产生另类为自发模型，即不用任何外界干预，动物自发，如黑鼠等。在选择动物模型时般应考虑动物的种属包括其生活习性关节结构组织学及病理学特征不同方法的造模机制和模型的特点，并应参照研究目的加以选择。在诱发模型中，常用的方法是手术造成关节的应力改变及关节腔内注入木瓜蛋白酶，这两种方法都能复制出较成功较高的模型，且操作较为简单。具体的造模机制在于低应力可以造成软骨厚度减少，染色变淡，水分增加，蛋白聚糖聚集度损伤等变化，木瓜蛋白酶作为种蛋白水解酶会引起关节软骨的退行性改变。在具体的造模过程中我们选用以上两种方法来分别复制动物模型。用于动物模型的动物般有狗兔鼠等，我们选用大鼠做模型，因为该模型关节软骨退变的组织学特征与人类相似，且动物来源较广泛，且经济。关节软骨细胞的获取和培养基于来源广泛，操作可行的原则，目前用于体外培养的软骨细胞般均为兔关节软骨细胞原代培养所得。软骨需在严格无菌的条件下分离，经过系列的漂洗消化等工作后获取软骨细胞。目前还没有专门用于软骨细胞培养的培养液，国外采用的培养液种类繁多，有改良等，国内的有高糖等，其中加入胎牛血清占，般以使用培养液居多。在培养液中还含有些辅助添加剂，包括丙酮酸钠谷氨酰胺二硫基乙醇以及万单位的青霉素和万单位的链霉素，。培养过程中般使用的恒温培养箱。采用的检测手段及指标在病理组织形态学的检查中，般采用以下几个观察指标大体肉眼观察软骨及滑膜表面情况染色观察有关的形态变化三色染色观察胶原的变化④即沙红染色用于组织学评分，评分方法按法电镜下观察软骨细胞内结构形态变化及其周围胶原纤维的变化。在细胞培养的相关检测中，我们采用法检测软骨细胞的增殖能力，用全自动生化分析仪对检测总蛋白含量，使用细胞流式仪进行细胞凋亡的测定，对含量的测定则使用分型试剂盒和试剂盒。目标达到的主要技术指标或技术经济指标技术特征及创新之处。现代科学技术与中医药理论相结合，深入研究中医药治疗的作用机制，为临床应用提供更加科学有利的客观依据，发挥中医药治疗的特色和优势，为临床常见严重影响人类健康的研究出有效安全便于推广应用的中医药治疗方对免疫性不孕的机理研究脑血通对急性出血性脑中风的实验研究茱萸颗粒对病毒性心肌炎免疫损伤作用的研究。完成新药基金的药效学和毒理学研究项，其中项为计划，编号，排名第项为口腔膜的研制省中管局排名第项为薤白胶囊的研制，省科委高新开发项目，排名第。近年来发表论文篇，其中国家级刊物篇第作者篇，省级刊物篇第作者篇。现阶段我们已完成了部分痛痹颗粒机理的实验研究，其中包括该方抗炎镇痛作用抗氧化作用及改善血液微循环等方面系列的实验工作，同时我们也进行了些预实验，包括对模型的复制等。已有以下主要仪器设备，可满足本项研究使用。超低温冰箱日本三洋公司倒置显微镜日本公司紫外分光光度计上海分析仪器总厂低温高速离心机德国公司蛋白核酸分析仪美国公司仪美国公司孔酶标仪美国公司紫外线检测仪上海长兴机械厂荧光定量分析仪美国公司电子天平上海天平厂净化工作台苏州净化设备厂恒温培养箱德国贺利氏公司欠缺的有细胞流式仪计划进度总研究期限年分三个阶段实施。第阶段调研及资料检索，准备阶段并上报待批。第二阶段完成全部实验工作。第三阶段资料汇总总结处理数据分析与研究成果撰写论文上报鉴定鉴定后申报成果。经费预算检索调研研制药物检查费购买特殊试剂盒打字复印约万。动物实验药理毒理细胞培养材料约万。总计万主要研究人员姓名性别年龄单位专业职务在本项目中的主要工作朱萱萱女江苏省中医院药学主任药师课题负责人董朝岚女南京中医药大学药学药理毒理刘丽敏女南京中医药大学药学药理毒理闻国兰女江苏省中医院动物饲养，使能迅速缓解症状，大大减轻病人痛苦，降低膝骨关节炎的致残率和复发率，且副作用小的简便廉验的中药制剂问世。治疗膝的新药生产及对其在治疗中所起作用机制的深入探讨，既符合国情又能够走向世界，产生较大的社会和经济效益，这必然形成高新技术产业进入高新领域，对促进科技进步，发展中医药，有着积极的作用，同时这也是中药现代化研究的发展方向和新的探索。实验研究方法及技术路线。对实验性大鼠骨性关节炎的防治作用模型的制备取雄性大鼠只，体重，固定，常规备皮消毒，沿髌韧带内侧缘切口，切断双后肢内侧副韧带及膝前内侧筋膜扩张部，并在断端处修剪去除约，造成双后肢膝外翻畸形。术后第二天放造模大鼠于拖箱内每天赶其行走。取雄性大鼠只，体重，木瓜蛋白酶溶液与半胱氨酸溶液混置小时后，分别在第天于实验大鼠膝关节腔内注入混合液。方法将造模后的大鼠随机分为模型组阳性对照组维骨力组治疗组，另设正常对照组，分别灌胃给药或蒸馏水，连续周。七周后将动物麻醉后，立即将大鼠以仰卧位固定，颈总取血，接入试管中，离心获取含药血清切开关节囊，进行大体观察后，然后以锐利刀片切取膝关节前正中部分的滑膜组织，作染色，电镜下观察。再用锐利刀片切取股骨内倮软骨使其呈全层软骨标本，戊二醛溶液固定，电镜下观察。所余之股骨内倮连同软骨下骨并切下，福尔马林溶液固定小时以上，分别作沙红及三色染色后光镜检查，取样后即可将动物处死。观察指标大体肉眼观察软骨及滑膜表面情况染色观察有关的形态变化三色染色观察胶原的变化④即沙红染色用于组织学评分，评分方法按法附评分等级表如下电镜下观察软骨细胞内结构形态变化及其周围胶原纤维的变化。评