细胞，得到进行，浓缩胶浓度，夹层胶浓度，分离胶浓度，按常规方法进行抗细菌活性的测定采用琼脂糖孔穴扩散法测定重组对金黄色葡萄球菌的抗菌活性对数生长期细菌按加入琼脂糖培养，凝固后用灭菌枪头打孔，在孔中加入待测样品液，于倒臵培养过夜，观察抑菌活性抗肿瘤毒性检测鼠嗜铬细胞瘤细胞培养于孔板，分别用不同浓度重组肽孵育收集细胞加入凋亡检测染色液和，室温避光反应，分别进行荧光显微镜观察和流式细胞仪检测，激发波长发射波长统计分析使用软件进行统计，获得至少次独立选单个克隆培养，提取质粒进行测序鉴定，获得重组表达菌和重组蛋白的诱导表达与纯化，摇床培养和至达到左右时，加入终浓度诱导，培养后，离心收集菌体细胞重悬于裂解缓冲液缓冲液，进行超声波破碎，离心收集裂解上清液将上清液上样于亲和层析柱，用含咪唑的洗脱缓冲液咪唑进行洗脱收集洗脱峰对应洗脱蛋白，用的缓冲液透析后得，保存备用重组蛋白质量的计算方法使用考马斯亮蓝试剂盒测定各个拷探讨在大肠杆菌系统基于串联表达策略制备重组的方法分子生物学论文，以实验室构建的载体为模板合成含有的核苷酸序列，和双酶切质粒和基因的产物，经连接后转化至平板上，倒臵培养，待长出单菌落提取单菌落中的质粒进行测序，获得正确的重组质粒表达载体和表达载体的构建用和以及和分别双酶切质粒，纯化后回收酶切片段，下用以作为融合标签，采取基因串联表达的策略，以期获得较高得率且有生物学活性的，为发展更有效的重组抗菌肽制备技术提供实验依据材料方法材料菌株与试剂大肠杆菌和金黄色葡萄球菌购自中国菌种保藏中心大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株由本实验室保藏表达载体为本实验室保存以及酶和蛋白质均购自生物公司胶纯化试剂盒质粒小提试剂盒购自诺唯赞公司就有明显的抑制作用和些抗生素之间存在协同作用，盐酸甲胺环素和联合使用能够显著提高对抗生素敏感的耐药金黄色葡萄球菌的抑菌作用另外，等发现对人类关节软骨和滑膜产生有效的抗分解代谢和抗炎作用等研究发现对人类白血病细胞有细胞毒性，但对正常人类淋巴细胞成纤维细胞或内皮细胞没有任何不良影响，可以通过诱导活性氧的产生诱导线粒体依赖的凋亡途径杀死癌细胞抗菌肽分子量小分子中含有碱性氨基酸使得对些蛋白酶敏感，并且也存在表达产物对宿主细胞的潜在毒性因此，为避免抗菌肽对宿主细胞的潜在毒性，降低蛋白酶的水解作用以及方便纯化和制备，通常采用大肠杆菌融合表达系摘要牛乳铁蛋白是种阳离子抗菌肽，具有抗细菌抗肿瘤等多种生物学活性本文探讨了利用融合标签在大肠杆菌系统中通过串联表达策略制备重组的方法结果显示，大于的蛋白以可溶形式表达于细胞中的表达量高于和特异性蛋白酶切除标签，羟胺释放单体，得到纯化的重组，产率约为果表明，重组具有定的抗菌和抗肿瘤活性本研究为结合标签与串联表达策略大量制备获得具有生物学功能的重组抗菌肽提供了种有效的方法关键词串联表达分子生物价值本研究利用大肠杆菌表达系统获得具有抗癌活性的重组，将推动在抗癌领域的应用结论本研究首次将标签融合和串联表达相结合，利用同尾酶技术成功构建出重组质粒，通过在串联序列间设计羟氨切割位点，利用酶和羟氨成功从融合蛋白释放出重组单体研究认为标签能显著促进的可溶性表达，并能在定程度上避免的宿主细胞毒性，其中个拷贝基因串联的宿主细胞毒性最低，产量最高获得的重组对金黄色葡萄球菌表现出定的抑菌作用，对大鼠嗜铬细胞瘤细胞具有促凋亡和坏死效应个拷贝的基因串性已有研究表明，天然对金黄色葡萄球菌具有抗菌作用本研究对纯化得到的重组进行抗活性鉴定，结果如图所示琼脂糖孔穴扩散法检测结果显示，的重组处理观察到抑菌圈，重组处理的抑菌圈更为明显，表明重组具有对的抗菌活性已有多个研究报道，标签可溶性表达获得的重组抗菌肽具有较好的抗菌活性，本研究采用融合个拷贝的串联表达，经酶和羟胺切割后得到了具有抗菌活性的重组，表明融合与串联表达相结合的策略，可以得到具有生物学活性溶解性，并且显著增强了，或的耐受性和生物积累因此，串联表达是提高产量的有效方式然而，对于不同的分子，串联数并非越多越好，最佳串联数取决于融合标签和串联肽的相互影响图酶切与纯化产物的鉴定超低分子量蛋白，纯化蛋白，酶切产物，酶切产物经纯化的重组经亲和层析纯化得到的融合蛋白用酶在酶切，以释放抗菌肽测定酶的酶切作用，结果如图所示可见酶能高效切割融合蛋白，释放的酶切反应体的未诱导菌液，融合蛋白经亲和层析之后的流出液，咪唑洗脱液，经亲和层析纯化获得的蛋白，免疫沉淀鉴定蛋白箭头指向融合蛋白和的蛋白纯化经诱导表达重组蛋白，将超声波破碎细胞的细胞上清液进行亲和层析，收集蛋白质峰对应样品，电泳分析如图所示在对应分子量处均有条明显而单的条带因为的端有，经抗体的分析进步证实纯化产物为融合蛋白在的培养体系中，纯化得到的探讨在大肠杆菌系统基于串联表达策略制备重组的方法分子生物学论文对采用系统原核表达优于单拷贝和拷贝串联多拷贝表达策略能在定程度上提高目的蛋白的表达量，但不是绝对的，即表达量和拷贝数不成正比，其具体原因和机理有待于进步探讨和研究本研究首次将融合与串连表达策略用于抗菌肽的大肠杆菌基因工程，为生产具有抗菌和抗癌活性的抗菌肽应用于临床提供了有效的方法刘珂杭，宗西翠，张慧丹，完颜杨珂，陈玉清牛乳铁蛋白活性多肽在大肠杆菌中的串联表达纯化及生物活性分析南京师大学报自然科学版，基金国家自然科学基金项目江苏省自然科学基金项目探讨在大肠杆菌系统基于串联表达策略制备重组的方法分子生物学论文揭示重组对肿瘤细胞的杀伤作用重组诱导的细胞凋亡，的重组可以诱导的细胞凋亡和的细胞坏死可见重组对细胞具有杀伤活性，能够诱导细胞凋亡，高浓度的重组还可以诱导细胞坏死近年来越来越多的研究揭示可以通过多种机制发挥对多种恶性肿瘤细胞的抗癌作用，可以靶向选择性地杀伤高转移性乳腺癌细胞和高转移性前列腺癌细胞可以通过提高抑癌基因的表达诱导凋亡抑制血管生成等多种途径发挥对结直肠癌的选择性抗癌作用对多种恶性肿瘤的选择性杀伤作用显示出其在抗癌领域的潜在应用的宿主细胞毒性最低，因此选取进行可溶性分析结果表明，的融合蛋白存在于超声上清液中，仅以包涵体形式表达由于抗菌肽自身的抗菌性，通常采用融合表达策略以降低潜在的宿主细胞毒性然而，并非所有的融合标签都能有效避免宿主细胞毒性，例如标签并不能有效避免宿主细胞毒性本研究发现标签融合能在定程度上避免宿主细胞毒性，并且影响的程度与串联拷贝数有关表达的宿主细胞毒性最大，表达的宿主毒性最低，推测原因可能在于不同拷贝数串联与在空间上的相互影响不同，能较好屏蔽，因此仅产生较弱的宿主细胞毒性的重组抗菌肽图重组对细胞的杀伤活性检测不同浓度重组孵育细胞后的形态学观察实验不同浓度重组处理肿瘤细胞后的流式细胞术分析重组对肿瘤细胞作用的分析天然对多种恶性肿瘤细胞具有抗癌活性本研究选用大鼠嗜铬细胞瘤细胞，评价重组对细胞的杀伤活性不同浓度的重组对肿瘤细胞处理后分别进行形态学观察和流式细胞分析，结果如图所示对照组的细胞形态完好，重组处理的细胞形态模糊而当浓度提高到，发生碎片化，表明大部分细胞死亡染色结合流式细胞术进用进行第次亲和纯化，收集不能被吸附的穿透峰样品，再用羟氨切割释放，透析处理去除羟胺等小分子成分得到纯化的样品，经电泳检测为分子量约，且在的培养基中能得到约的重组酶是种识别空间结构并切除的特异性酶，无需添加任何酶切位点，因此切割产物中无额外的氨基酸序列酶独特的切割方式对表达小分子多肽非常有利，因为额外的氨基酸序列对小肽的功能影响可能比大分子蛋白更为显著大量的研究显示，酶切割释放的抗菌肽具有很好的生物学活性，进步显示融合表达系统在抗菌肽基因工程领域的优势图重组对金黄色葡萄球菌的抗菌检测检测重组的抗菌和的产量分别为和标签融合表达设计时通常在的端添加，以便于亲和纯化和检测，本研究用高效纯化出，以用于后续进步的切割与纯化尽管多聚体串联表达时随着肽与载体的质量比的增加，可能提高肽的产量和稳定性本研究却发现，个串联表达得到的产量高于单拷贝和拷贝串联表达的产量，可见融合蛋白的表达量与串联拷贝数间并无线性正相关有报道通过重叠延伸将蟹基因的个和个拷贝的串联重复序列整合在起，采用融合表达系统在大肠杆菌中表达，增加了重组蛋白的稳定性和标签已广泛用于抗菌肽的表达而避免了宿主细胞毒性，例如和等抗菌肽，有研究认为，标签能通过周围亲水和中心疏水核心结构显著提高融合抗菌肽的可溶性表达标签能有效帮助蛋白质折叠，显著提高包括抗菌肽在内的多种蛋白的可溶性表达，本研究也发现，即使是个的串联抗菌肽，标签也能实现的可溶性表达图蛋白纯化与鉴定的分析蛋白纯化后验证蛋白纯化后验证蛋白纯化后验证蛋白分子，探讨在大肠杆菌系统基于串联表达策略制备重组的方法分子生物学论文重组菌株，重组菌株加入诱导不同时间，测定表达产物对宿主细胞的毒性，结果如图所示各重组菌株的生长速度比较如下，的表达对宿主菌的生长有定抑制作用其中和的表达对生长的抑制作用相对较强，的表达对生长的抑制作用最弱，即宿主细胞毒性最低，诱导后，收集蛋白进行分析，结果如图所示分别检测到约和蛋白的诱导表达，与，和的分子量基本致由于实验的所有数据并表示为平均值标准偏差使用单因素方差分析分析数据以确定不同组之间的显著差异被认为具有统计学意义结果与讨论表达质粒的构建为提高抗菌肽的表达产量，通常采用串联多聚体形式来代替单体形式进行抗菌肽的融合表达，是本实验室前期构建的个带有标签的原核表达质粒，具有等多克隆酶切位点将扩增得到的基因片段和经和双酶切后连接获得利用同