，选用检验进行统计分析，为差异有显著性意义。

结果人骨髓间充质干细胞膜片表征人骨髓间充质干细胞高密度接种后连续培养周，培养皿底可见呈现乳白色半透明的薄膜样物质，见图，将该膜状物夹起后自然收缩，具有定弹性，见图。

镜下观察显示，高密度接种的人骨髓间充质干细胞迅速融合，后细胞融合并持续生长形成致密的细胞膜片继续培养，单个细胞形态消失充质干细胞复合人脐静脉内皮细胞构建预血管化成骨细胞膜片中国组织工程研究，基金国家自然科学基金，项目负责人马东洋。

探讨预血管化成骨细胞膜片在人骨髓间充质干细胞复合人脐静脉内皮细胞基础上的构建细胞学论文。

按如下方法进行染色人脐静脉内皮细胞或成骨诱导细胞膜片用磷酸盐缓冲液冲洗次，每次，然后室温下加入多聚甲醛溶液固定，去除多聚甲醛，磷酸盐缓冲液冲洗次，加入适量体积分数为山羊血清室温下封闭膜片，磷酸盐缓冲液洗次，每次，将鼠抗人抗用按∶比例稀释鼠抗人型胶原抗用按∶比例稀释加入孔板内，放于湿盒内静臵孵育过夜，磷酸盐缓冲液冲洗次，将山羊抗鼠抗标记，按∶比例稀释加入孔板使膜片完全浸润，室温避光条件下孵育，磷酸盐缓冲液漂洗次，最后加入足够染色液进行胞核复染，冲洗，镜下观察并拍照。

主要观察指标细胞膜片形貌图成骨诱导细胞膜片型胶原免疫荧光染色标尺为图注图中为单纯成骨诱导细胞膜片对照组为成骨诱导细胞膜片接种人脐静脉内皮细胞，型胶原中出现空泡样结构，局部放大图显示空泡样结构更加典型为型胶原免疫荧光染色为染色为为图局部放大。

白色箭头指示空泡样结构，红色抗体，蓝色研究表明，在血管内皮细胞和成骨细胞共培养过程中发现了大量具有调控作用的细胞因子，包括血管内皮生长因子血小板衍生因子转化生长因子转化生长因子成纤维细胞生长因子骨形成蛋白表皮生长因子和骨保护素等。

骨髓间充质干细胞与血管内皮细胞混合后培养，具有周细胞的功能，有利于成熟血管系统的建立，并且在基于细胞膜片构建的骨样组织中可以维持血管网络的稳定性。

课题组既往研究发现，来源于成骨诱导细胞膜片和未分化人骨髓间充质干细胞膜片的细胞外基质中型胶原蛋白和纤维粘连探讨预血管化成骨细胞膜片在人骨髓间充质干细胞复合人脐静脉内皮细胞基础上的构建细胞学论文连接形成管腔样结构。

在此过程中，主要是人脐静脉内皮细胞通过基质金属蛋白酶的水解作用，对细胞外基质进行了重排和修饰，在细胞外基质微环境中形成物理性空间即空泡样结构，为血管的形态发生周细胞的募集以及基底膜基质的组装提供了条件。

图细胞膜片表征标尺为，标尺为图注图中为膜片大体观，形成乳白色半透明薄膜样物质为膜片分离后自然收缩，具有定弹性为显微镜下成骨诱导细胞膜片多角形成骨样细胞，黄色箭头示矿化结节为显微镜下对照组未分化人骨髓间充质干细胞膜片为成骨诱导细胞膜片碱性磷酸酶染色为未分化人骨髓间充质干细胞膜片碱性磷酸酶染色为成骨诱导细胞膜片茜素红染色为未分化人骨髓间充质干细胞膜片茜素红染色图荧光显微镜下内皮管腔形成过程标尺为图注图中依次为成骨诱导细胞膜片上接种人脐静脉内皮细胞，以及，时进行性管腔的形成过程为人脐静脉内皮细胞在培养皿内单独培养呈铺路石胞接种到多层骨骼肌成肌细胞膜片上，发现人脐静脉内皮细胞从多层骨骼肌成肌细胞膜片底部逐渐向上迁移爬行，并最终在膜片的中层和顶部形成血管网状结构。

课题组既往研究亦证实人骨髓间充质干细胞膜片为人脐静脉内皮细胞血管网在各个方向上的生长和迁移提供了维微环境，。

该研究发现人脐静脉内皮细胞接种至成骨诱导细胞膜片之后，人脐静脉内皮细胞发生迁移逐渐重排，并形成毛细血管样网络结构和微血管空腔样结构，显示了血管腔形成的进行性动态过程。

然而，人脐静脉内皮细胞单独在培养皿表面培养而没有成骨诱导细胞膜片支持时，内皮细胞则呈铺路石样随机型分布，并无管网状管腔样结构的发生。

这个结果进步说明血管网的形成和血管化的进程是由成骨诱导细胞膜片及其与人脐静脉内皮细胞的相互作用共同促进的。

在此过程中有个方面的作用，方面是细胞与细胞之间，即人脐静脉内皮细胞和成骨诱导人骨髓间充质干细胞之间的相互作用另方面在于来源于成骨诱导人骨髓间充质干细胞到第天时内皮细胞之间互相连接局部融合，并形成小的空泡样结构，见图接种第天时，可见细长的分支和细胞间管腔样结构，见图。

然而，在培养皿内单纯培养的人脐静脉内皮细胞组则表现出内皮细胞铺路石样随机排列，并未发现有类似的改变，见图。

免疫荧光染色结果免疫荧光染色检测显示成骨诱导细胞膜片接种人脐静脉内皮细胞后，以及，时进行性管腔的形成过程。

接种人脐静脉内皮细胞至成骨诱导细胞膜片时，人脐静脉内皮细胞变得细长，见图后，人脐静脉内皮细胞在成骨诱导细胞膜片上发生迁移并动态排列，见图培养至时，人脐静脉内皮细胞发生融合，形成空泡样结构，见图，此时形成的管腔样结构数量达最大，见图随时间延长，更多的人脐静脉内皮细胞延长并且动态排列培养至时，些空泡开始聚集，见图，形成的管腔样结构数量反而下降。

单纯的成骨诱导细胞膜片未接种人脐静脉内皮细胞表达阴性，见图单纯在培养皿内的人脐静脉统计学分析选取在同实验条件下及同拍摄条件下获取的图片进行处理分析。

通过软件计数图片中形成的管腔状结构的数目。

所得计量资料表示为，选用检验进行统计分析，为差异有显著性意义。

结果人骨髓间充质干细胞膜片表征人骨髓间充质干细胞高密度接种后连续培养周，培养皿底可见呈现乳白色半透明的薄膜样物质，见图，将该膜状物夹起后自然收缩，具有定弹性，见图。

镜下观察显示，高密度接种的人骨髓间充质干细胞迅速融合，后细胞融合并持续生长形成致密的细胞膜片继续培养，单个细胞形态消失，细胞逐渐融合成片，成骨诱导细胞膜片钙盐逐渐沉积，时可见白色的矿化结节形成，见图。

碱性磷酸酶染色发现，成骨诱导细胞膜片内有较多的大小不等的橘黄色沉淀，见图，茜素红染色发现数个大小不的深红色结节，见图，而未分化对照组膜片碱性磷酸酶染色和茜素红染色均呈阴性，见图，。

内皮血管网的形成人骨髓间充质干细胞以密度接种利的在基于细胞膜片构建的骨样组织中可以维持血管网络的稳定性，是构建细胞膜片较为理想的种子细胞来源。

血管内皮细胞与成骨细胞之间的关联可能通过调节血管形成以及骨形成细胞的分化从而调节骨代谢，。

但是，将骨髓间充质干细胞不传代进行连续培养形成细胞膜片后是否仍然具有成骨分化的潜能，对于能否成功构建工程化骨组织相当重要。

该研究将人脐静脉内皮细胞均匀接种在预先培养的成骨诱导骨髓间充质干细胞膜片上，拟在体外构建具有成熟稳定的预血管化网络结构的成骨诱导细胞膜片，进而观察此种模式下人脐静脉内皮细胞的血管网形成潜力以及者的相互作用关系，以期为优化构建维预血管化骨组织奠定实验基础。

实验方法细胞培养人骨髓间充质干细胞培养在含体积分数为胎牛血清和古洛糖醛酸青霉素链霉素的低糖未分化基础培养液中。

绿色荧光蛋白标记的人脐静脉血内皮细胞培养在含体积分数为胎牛血清和内皮细胞生长介质的内皮细胞培养液中，每更换次培养液。

所细胞在成骨诱导细胞膜片上培养，以及为图中局部放大图为图中局部放大图为单纯成骨诱导细胞膜片染色阴性，仅显示细胞核结构为人脐静脉内皮细胞在培养皿内单独培养呈铺路石样随机排列为定量分析管腔样结构的数量。

白色箭头显示空泡样结构及管腔的形成，红色标记蓝色图成骨诱导细胞膜片型胶原免疫荧光染色标尺为图注图中为单纯成骨诱导细胞膜片对照组为成骨诱导细胞膜片接种人脐静脉内皮细胞，型胶原中出现空泡样结构，局部放大图显示空泡样结构更加典型为型胶原免疫荧光染色为染色为为图局部放大。

白色箭头指示空泡样结构，红色抗体，蓝色研究表明，在血管内皮细胞和成骨细胞共培养过程中发现了大量具有调控作用的细胞因子，包括血管内皮生长因子血小板衍生因子转化生长因子蛋白碱性磷酸酶纤维粘连蛋白骨涎液蛋白等组分的细胞外基质的产生。

该实验发现人脐静脉内皮细胞复合成骨诱导细胞膜片共培养后检测到了型胶原的存在，与此同时在血管化进程中型胶原中出现了空泡样结构，说明在此过程中型胶原发生了改建。

还有研究证实，内皮细胞接种至型胶原细胞基质胶等诱导型基质中时，内皮细胞迅速重组，在数小时之后便可以相互连接形成管腔样结构。

在此过程中，主要是人脐静脉内皮细胞通过基质金属蛋白酶的水解作用，对细胞外基质进行了重排和修饰，在细胞外基质微环境中形成物理性空间即空泡样结构，为血管的形态发生周细胞的募集以及基底膜基质的组装提供了条件。

图细胞膜片表征标尺为，标尺为图注图中为膜片大体观，形成乳白色半透明薄膜样物质为膜片分离后自然收缩，具有定弹性为显微镜下成骨诱导细胞膜片多角形成骨样细胞，黄色箭头示矿化结节为显微镜下对照组未分化人骨髓间充质干细胞膜片为成骨诱导细胞膜。

讨论该研究将人骨髓间充质干细胞连续培养周并经成骨诱导，可以获得完整的成骨诱导细胞膜片，通过将人脐静脉内皮细胞与成骨诱导细胞膜片共培养，体外成功构建了具有预血管化网络结构的细胞膜片。

实验结果证实，成骨诱导细胞膜片可以促进人脐静脉内皮细胞迁移重排，进而形成血管样网络结构和微血管空腔。

年，将人脐静脉内皮细胞接种到多层骨骼肌成肌细胞膜片上，发现人脐静脉内皮细胞从多层骨骼肌成肌细胞膜片底部逐渐向上迁移爬行，并最终在膜片的中层和顶部形成血管网状结构。

课题组既往研究亦证实人骨髓间充质干细胞膜片为人脐静脉内皮细胞血管网在各个方向上的生长和迁移提供了维微环境，。

该研究发现人脐静脉内皮细胞接种至成骨诱导细胞膜片之后，人脐静脉内皮细胞发生迁移逐渐重排，并形成毛细血管样网络结构和微血管