关于小立碗藓PpACL1的生物学分析及晶体制备（晶体学论文） ㊣ 精品文档 值得下载

子交换层析纯化步骤中，使用阴离子交换层析柱预装柱的纯化介质亲和层析为获得高纯度的重组蛋白，用于结构生物学研究，首先采用了亲和纯化的方法表达有蛋白的大肠杆菌经过超声破碎和离心，其上清液被用于介质亲和层析结合有重组蛋白的化，其中平衡步骤使用用于重悬菌体的缓冲液氯化钠洗涤步骤使用含有咪唑，氯化钠，的缓冲液洗脱步骤使用含有咪唑，氯化钠，的缓冲液阴离子交换层析亲和层析得到的蛋白用公司生产的离心超滤管脱盐处理后，用公司生产的在阴离子交换层析柱中进行上关于小立碗藓的生物学分析及晶体制备晶体学论文预装柱和预装柱蛋白纯化所用到的其余试剂购买自生工科技有限公司和有限公司蛋白浓缩使用公司生产的离心超滤管晶体筛选所用试剂为公司生产的和试剂盒以及公司生产的和试剂盒添加剂筛选使用体衍射法得到解析，高等植物蛋白的活性部位也已被确定，并且建立了基于结构的催化模型，因此如果能够得到蛋白的高质量晶体，并通过射线衍射法测定其维结构，那么就可以对小立碗藓和高等植物的进行结构对比，从而找出其活性中心的结构差异，进而阐明酶活性差异的产生原因在本研究中，我们首先对蛋白进行了表达纯化和结晶，并获得了种体积较大且棱角分明的晶体，然而其衍射分辨率却很低的成熟，无不受到乙烯的调节不仅如此，乙烯还参与植物对病害干旱寒冷高盐等逆境的适应这些调控功能与人类的农业林业和园艺生产息息相关高等植物的乙烯合成路径已经通过生化研究被基本阐明其合成路线始于腺苷甲硫氨酸合成酶以甲硫氨酸和为底物催化生成腺苷甲硫氨酸随后，氨基环丙烷羧酸合酶将转化为氨基环丙烷羧酸和甲硫腺苷最后氧化酶催化的氧化反应，生成最终摘要乙烯是种重要的植物激素，氨基环丙烷羧酸合成酶是高等植物乙烯合成途径中的限速酶和主要调节位点然而低等陆生植物小立碗藓基因组编码的同源蛋白却被发现不具有活性，而是具有裂解酶活性为了探究与高等植物酶活性差异的成因，采用结构生物学方法来进行研究对小立碗藓蛋白进行了表达纯化和结晶，得到了大且棱角分明的块状晶体，然而该晶体的射到的晶体的衍射数据分辨率严重依赖于防冻处理，在无防冻剂处理时，衍射图样中冰环现象严重，且无可辨认的衍射点，而在使用防冻剂后，不仅衍射图谱中冰环几乎消失，而且衍射结果最高分辨率提高到了，还能够保护晶体内部有序性不被破坏，这与前人的观点相吻合本研究中的蛋白纯化和结晶过程中，并没有去除蛋白端的，而晶体必须在含有对柔性肽段具有稳定作用的多元醇的条件下生了提高衍射数据质量，进行了添加剂筛选工作，发现在原结晶条件的基础上加入碘化钠，可以使晶体的外观改变成棱柱形状该棱柱形状的晶体在有防冻剂处理的前提下，射线衍射分辨率可达在晶体优化工作中，发现在池液中添加碘化钠改变晶体外观的同时，显著提高了晶体的衍射分辨率这说明添加剂碘化钠可能改变蛋白分子的表面性质，使其在结晶过程中的堆积更加有序此外，还发现，当池液中不存在或甘油等多羟基化晶体进行了射线衍射，发现该晶体的衍射严重依赖于防冻处理在无防冻剂处理时，上述晶体的射线衍射如图所示，其冰环严重且无可分辨的衍射点然而经过防冻剂铵，氯化钠，甘油，处理后，上述晶体的射线衍射则如图所示，其衍射图像中的冰环几乎消失，衍射点清晰可见，且衍射分辨率得到了显著提高，最高可以达到，为接下来的结构解析打下了重要基础图晶体的射线衍射鉴定结果图添加剂筛选及优化结果图碘晶体内部蛋白分子的有序堆积，进而影响衍射分辨率因此为了解决晶体结冰问题，用铵，氯化钠，甘油作为防冻剂，对晶体进行了防冻处理如图所示，与防冻处理前的晶体相比，经防冻剂处理的晶体的射线衍射图谱中的冰环明显减轻至几乎消失图，然而衍射分辨率依然局限在左右这说明该重组蛋白晶体的衍射分辨率较低并不主要是由溶剂结冰造成，因此接下来计划使用添加剂对蛋白晶体进行进步优化添关于小立碗藓的生物学分析及晶体制备晶体学论文长这事实，暗示了分子内部有阻碍有序堆积的片段存在因此，在后续研究中，将尝试在端和之间插入酶切割序列，以便通过酶切法去除，并继续对池液条件进行优化，从而得到具有更高衍射分辨率的晶体郝博威，张永艳，韩旭，李鑫，王宁宁，饶子和小立碗藓的晶体制备南开大学学报自然科学版，基金国家自然科学基金关于小立碗藓的生物学分析及晶体制备晶体学论文蛋白晶体生长依赖于多元醇的情况也曾在聚合酶的晶体学研究中发现多元醇化合物被认为能够稳定柔性肽段的构象，防止异质性聚合和蛋白分子的局部变性自世纪年代以来，已经在研究中意识到蛋白质晶体在冷冻的过程中需要适合的防冻处理，如果防冻措施不适当，会造成晶体内部水分凝结为冰晶，不仅会在衍射图样中产生冰环影响数据处理，还会对晶体内部的有序性产生破坏，甚至引起晶体断裂在本次研究中，发现在使用碘化钠添加剂后得生产的试剂盒的号条件和试剂盒的号条件中观察到了重组蛋白的晶体这两个结晶条件分别为铵，甘油，晶体的优化池液成分优化结晶条件筛选得到的两种结晶条件的成分非常相似，沉淀剂均为硫酸铵，且都含有多羟基化合物或甘油，值均为弱碱性和因此，以弱碱性缓冲体系加硫酸铵加多羟基化合物这物时，晶体不能生长鉴于或甘油在池液中的浓度，它们可能也是作为添加剂起作用的前人曾报道过，不同于小分子的结晶过程，蛋白分子具有定的柔性，在结晶过程中可能会出现肽链伸展和结构域之间的相对滑动这些动态过程会对晶核形成和晶体内部的堆积过程产生熵障碍克服熵障碍的常用方式是使用添加剂添加剂可以与蛋白分子表面相互作用，改变蛋白分子的水化程度，使蛋白在聚集过程中维持天然构象，促进晶体内部的有序堆积化钠添加剂条件下晶体的射线衍射鉴定结果讨论在本研究中，以大肠杆菌原核表达体系对重组蛋白进行了表达，依次通过亲和层析离子交换层析和凝胶过滤层析对重组蛋白进行分离和纯化，得到了适用于晶体制备的重组蛋白样品经过结晶条件筛选和优化工作后，得到了直径约，棱角分明，从外观上可以观察到次轴对称关系的块状晶体然而该晶体的射线衍射分辨率却仅为左右随后，为剂优化使用公司生产的对晶体进行了进步优化结果如图所示，发现在原结晶条件的基础上添加碘化钠后，晶体外观发生了显著变化晶体形状改变往往意味着晶体内部分子的堆积方式发生了变化，衍射分辨率可能因此而得到显著提高所以在此基础上又对的结晶条件进行了进步优化，结果发现在硫酸铵，甘油，现为长度约的棱柱状，如图所示用上述棱柱状样的池液组合为基础，进行优化经过优化后，确定了晶体的最优生长条件为铵，甘油如图所示，此条件下生长的晶体呈块状，直径为左右，各晶面发育良好，棱角分明，从外观上可以明显地观察到重对称关系然而当使用上述晶体进行射线衍射时，其衍射分辨率仅为到，且衍射图像中冰环严重，如图所示图晶体筛选及优化结果防冻剂优化据前人报道，晶体结冰不仅会使衍射图像中出现冰环，而且还可能会破坏关于小立碗藓的生物学分析及晶体制备晶体学论文唑洗脱图离子交换层析与凝胶过滤层析纯化结果阴离子交换层析结果，横轴为洗脱体积，纵轴为洗脱液电导率凝胶过滤层析结果，横轴为洗脱体积，纵轴为紫外吸光值凝胶过滤层析主洗脱峰电泳结果结晶条件筛选上述纯化的重组蛋白被用于结晶条件筛选使用座滴气相扩散法，筛选了实验材料与方法中所述的种商业化结晶条件，并且最终在公司介质经过含有咪唑的缓冲液洗涤之后，重组蛋白被含有咪唑的缓冲液洗脱结果如图所示，洗脱的样品中主条带明显，且大小与单体预期分子量符合离子交换层析与凝胶过滤层析经亲和层析纯化获得的重组蛋白被首先用于阴离子交换层析纯化结果如图所示，洗脱缓冲液电导率达到左右时出现主洗脱峰，其峰型较为单对称该主洗脱峰被进步用于凝胶过滤层析纯化，结果如，然后使用不含盐的缓冲液和高盐缓冲液氯化钠，建立盐浓度梯度，对重组蛋白进行梯度洗脱，收集主洗脱峰，用于接下来凝胶过滤层析纯化凝胶过滤层析阴离子交换层析得到的重组蛋白经过浓缩，用含有氯化钠，的缓冲液进行凝胶过滤层析主洗脱峰被收集起来，用于蛋白晶体制备蛋白晶体制备结晶条件筛选和添加剂筛选使用座滴气相扩散法完成，结晶条件优化使用悬滴气相扩公司生产的试剂盒其余结晶条件优化所需试剂购买自公司实验方法重组蛋白的表达和亲和层析纯化将过夜培养的表达菌株转入液体培养基中，在条件下培养后，降温至，加入至终浓度为，诱导后离心收集菌体用含有氯化钠，的缓冲液重悬菌体，并用超声法破碎离心收集上清后，用包含平衡上样洗涤和洗脱等步骤的标准的亲和层析方法加以纯此又对该蛋白晶体进行了系列的后续优化工作，最终得到了衍射分辨率达到蛋白晶体，为进步解析其结构打下基础材料与方法实验材料实验中使用的表达菌株由本课题组所保存，具体的基因的克隆和载体构建方法如以前所报道实验仪器和试剂蛋白亲和纯化所用亲和层析介质为公司生产的子交换层析和凝胶过滤层析分别使用公司生产的产物乙烯这个合成路径中，催化形成的步骤是最重要的限速步骤，也是最重要的调节位点，在低等陆生植物小立碗藓的基因组中也存在两个同源基因，和，它们的编码产物与高等植物苹果的序列同源性分别达和然而前期工中作发现和均不具备活性，而其中的却具有裂解酶活性截至目前，高等植物苹果和番茄的蛋白分子的维结构已通过射线晶射线衍射分辨率却仅有左右为得到可用于结构解析的晶体，进行了添加剂的筛选以及晶体的防冻处理等优化工作，使晶体衍射质量得到了显著提高，最终收集得到了最高分辨率达的晶体衍射数据，初步具备了结构解析的条件关键词乙烯合成小立碗藓晶体制备晶体学蛋白纯化乙烯是种气态的植物激素，其调节作用贯穿高等植物的整个生命周期从合子的形成幼苗的萌发根尖和芽的生长叶片的衰老花期的决定果