酶切检测。

分别以与作单酶切检测，结果显示这个质粒能切出预期片段，而号质粒进行序列测定，质粒测序由北京天润奥科生物科技有限公司完成。

长基因定点突变制作中部分扩增与双片段连接的融合遗传工程论文。

图扩增含突变位点的基因片段上述产物双酶切简单易行图泳道。

将原始质粒以双酶切，得到个片段，其中最小的片段即所需的片段，它与片段相距较远，容易分离回收图泳道。

将原始质粒以双酶切可得到两长基因定点突变制作中部分扩增与双片段连接的融合遗传工程论文加缓冲液取质粒稀释到中，加缓冲液。

电泳检测后将目标片段回收至中，用连接载体，两个片段各，混合，。

连接产物直接转化感受态大肠杆菌，然后涂布在含卡那霉素的固体培养基平板上，培养过夜。

菌落检测与序列分析在过夜培养的平板上随机挑取数个成型菌用或酶切位点将该片段连入载体构建完整的突变体质粒。

为寻找最佳解决方案，依上述思路按定点突变法进行对比操作。

基因克隆扩增含突变位点的目标基因采用高保真。

方案如下总体积，含缓冲液，上游引物下游引物，酶，质粒运行程序，个循环可能，而且随着目标产物长度增加，随机突变的概率也逐渐增加。

由于以上两点，在制作长基因定点突变时往往并不顺利。

因此，在遇到相应问题时，有科研工作者会转向滚环扩增法。

滚环扩增法也是目前市场上大多数突变试剂盒所采用的基本原理，如及碧云天基因定点突变试剂盒等，。

长基因定点突变制作中部分扩增与双片段连关键词基因克隆定点突变视网膜母细胞瘤基因遗传工程重叠延伸基因定点突变是常用的分子生物学技术，是蛋白质结构与功能研究的基础手段。

目前基因定点突变主要采用基于聚合酶链式反应的突变引入办法。

最早开发出来的重叠延伸是基因突变的主要方法，近年来还发展出大引物法与滚环扩增法等定点突变方法，。

这些方法各有优劣，不同实验室在选择基因定点突变方法时有所偏好。

包括两轮扩增大肠杆菌感受态购自天根生化科技北京有限公司质粒由北京大学生命科学学院张传茂教授馈赠。

摘要重叠延伸是基因定点突变的主要方法，但是以该方法制作长基因定点突变时，往往遇到难以获得第轮产物或容易引入新的非预期突变等问题。

此时，可先以重叠延伸扩增含突变位点的部分基因片段，再将其连入适当载体获得重组质粒。

若该扩增片段两侧的酶切位点在质粒载体上则可采用双片段连接法构建完整质粒。

以制作视网膜母细胞瘤基因定点突变为例，直接以重叠延伸扩增全长基因时未能得到理想的目标产物。

故先扩增含点突变的片段，再将其与源自原始质粒的片段起连入含片段的质粒载体而构建完整质粒。

两个筛选出的重组质粒经序列检测完全符合目标突变序列特征，验证了该方案的可行性。

该方法作为重叠延伸的补充，可为许多长基因定点突变提供解决方案。

视干扰了上下游片段的末端互补所致。

另方面，体外扩增时总是存在随机突变的可能，而且随着目标产物长度增加，随机突变的概率也逐渐增加。

由于以上两点，在制作长基因定点突变时往往并不顺利。

因此，在遇到相应问题时，有科研工作者会转向滚环扩增法。

滚环扩增法也是目前市场上大多数突变试剂盒所采用的基本原理，如及碧云天完整的突变体质粒。

为寻找最佳解决方案，依上述思路按定点突变法进行对比操作。

关键词基因克隆定点突变视网膜母细胞瘤基因遗传工程重叠延伸基因定点突变是常用的分子生物学技术，是蛋白质结构与功能研究的基础手段。

目前基因定点突变主要采用基于聚合酶链式反应的突变引入办法。

最早开发出来的重叠延伸是基因突变的主要方法，近年来还发展出大引物法与滚环扩增法等定点突变方法，。

长基因定点突变制作中部分扩增与双片段连接的融合遗传工程论文不单，则可采用双片段连接法构建完整质粒。

以制作视网膜母细胞瘤基因定点突变为例，直接以重叠延伸扩增全长基因时未能得到理想的目标产物。

故先扩增含点突变的片段，再将其与源自原始质粒的片段起连入含片段的质粒载体而构建完整质粒。

两个筛选出的重组质粒经序列检测完全符合目标突变序列特征，验证了该方案的可行性。

该方法作为重叠延伸的补充，可为许多长基因定点突变提供解决方修饰，唯有是较为可信的磷酸化位点，将蛋白突变为可模拟其磷酸化修饰效果，进而研究其调节机制。

由于基因编码区较长，常规制作突变体时遇到困难。

采用部分扩增与双片段连接法相结合，成功克隆了突变体并将其连入质粒载体，为进步研究该基因的调节机制做好了基础准备，同时也提供了种有效的长基因定点突变解决方案。

材料与方法菌种与质，上游引物下游引物，菌液，补水至扩增条件为，个循环。

另对部分克隆取菌液小量提取质粒进行酶切检测，方案为缓冲液，内切酶小提质粒。

产物及酶切产物皆经琼脂糖凝胶电泳分析。

取个经验证的阳性质粒进行序列测定，质粒测序由北京天润奥科生物科技有限公司完成。

表本研究所用引物结果膜母细胞瘤基因，是典型的抑癌基因，基因缺失与突变是众多肿瘤发生的重要诱因。

基因转录终产物约，其开放阅读框全长，编码个氨基酸。

在细胞周期的期，蛋白相继被与磷酸化，释放与之结合的，从而启动转换，。

蛋白端有数个潜在磷酸化位点，其中大多受基因定点突变试剂盒等，。

长基因定点突变制作中部分扩增与双片段连接的融合遗传工程论文。

摘要重叠延伸是基因定点突变的主要方法，但是以该方法制作长基因定点突变时，往往遇到难以获得第轮产物或容易引入新的非预期突变等问题。

此时，可先以重叠延伸扩增含突变位点的部分基因片段，再将其连入适当载体获得重组质粒。

若该扩增片段两侧的酶切位点在质粒载体上不单，些方法各有优劣，不同实验室在选择基因定点突变方法时有所偏好。

包括两轮扩增，第轮分别扩增基因上下游片段，第轮通过上下游片段的末端重叠延伸产物作为模板扩增全长基因。

很多科研工作者都有类似的经验，即上下游片段较小时，第轮容易成功随着上下游基因片段长度增加，第轮成功率逐渐降低当片段超过时，第轮不易获得目标产物。

般认为是较长的基因片段分析不同方案下目标突变体的扩增欲制作定点突变，需将基因编码区位突变为。

考虑到该基因较长，采用常规法可能不易得到理想的第轮产物。

对作限制性酶切分析，发现目标突变位点上游处有个位点，另上游处有个位点图。

因此，可以仅对或部分做扩增，再利用或酶切位点将该片段连入载体构建长基因定点突变制作中部分扩增与双片段连接的融合遗传工程论文中，加缓冲液。

电泳检测后将目标片段回收至中，用连接载体，两个片段各，混合，。

连接产物直接转化感受态大肠杆菌，然后涂布在含卡那霉素的固体培养基平板上，培养过夜。

菌落检测与序列分析在过夜培养的平板上随机挑取数个成型菌落，臵于含卡那霉素的培养基中继续培养，以菌液为模板进行检测。

方案预期片段图，。

酶切检测结果与检测结果致。

基因克隆扩增含突变位点的目标基因采用高保真。

方案如下总体积，含缓冲液，上游引物下游引物，酶，质粒运行程序，个循环。

第轮方案总体积，含缓冲液，片段，其中大片段即所需的载体部分图泳道，它含有部分。

图双片段连接示意图图基因片段及载体的限制性酶切目标质粒的检测与鉴定连接产物转化感受态大肠杆菌后经卡那霉素选择性平板培养基筛选，得到数十个菌落图，明显少于本实验室单片段连接时的菌落形成数。

从中任意挑取个菌落，经适当培养后进行检测鉴定。

以两种不同的引物组合进行检测，方案选用引物组合阳性结果表示质粒，臵于含卡那霉素的培养基中继续培养，以菌液为模板进行检测。

方案，上游引物下游引物，菌液，补水至扩增条件为，个循环。

另对部分克隆取菌液小量提取质粒进行酶切检测，方案为缓冲液，内切酶小提质粒。

产物及酶切产物皆经琼脂糖凝胶电泳分析。

取个经验证的阳性质粒。

第轮方案总体积，含缓冲液，上游引物下游引物，酶，上游片段下游片段运行程序，个循环。

产物经电泳检测后回收至中。

酶切方案取回收物，加缓冲液另取质粒稀释到中，的融合遗传工程论文。

表本研究所用引物结果与分析不同方案下目标突变体的扩增欲制作定点突变，需将基因编码区位突变为。

考虑到该基因较长，采用常规法可能不易得到理想的第轮产物。

对作限制性酶切分析，发现目标突变位点上游处有个位点，另上游处有个位点图。

因此，可以仅对或部分做扩增，再利增，第轮分别扩增基因上下游片段，第轮通过上下游片段的末端重叠延伸产物作为模板扩增全长基因。

很多科研工作者都有类似的经验，即上下游片段较小时，第轮容易成功随着上下游基因片段长度增加，第轮成功率逐渐降低当片段超过时，第轮不易获得目标产物。

般认为是较长的基因片段干扰了上下游片段的末端互补所致。

另方面，体外扩增时总是存在随机突变的