。

关键词分子生物仪，反应结束后，取产物利用核酸胶电泳检测验证，通过胶回收纯化回收目的条带，命名为并将其重组到质粒上，取重组质粒电转入大肠杆菌感受态细胞，电击后加入液体培养基混匀，摇床中孵育，分别涂布于含有的固体平板抗性筛选，恒温培养箱倒臵过夜培养。

收集到的菌体用质粒小提试剂盒抽提质粒，按其说明书操作。

酿酒酵母的转化用载体法高效转化冷冻活性酵母细胞，具体操作步骤如下将值缓冲液，去离子水。

表达培养基，值缓冲液，去离子水，过滤除菌。

转录调节序列突变库构建将实验室保藏的大肠杆菌划线于固体平板，挑取单克隆接种于液体培养基，并于的恒温摇床中过夜培养。

利用质粒小提试剂盒提取质粒，作为易错的模板，以调节区域为上游引物，其碱基序列为探讨定向进化转录调节基因在对漆酶异源表达的作用分子生物学论文，值缓冲液，去离子水，过滤除菌。

酿酒酵母高活性突变体序列测定酿酒酵母高活性突变体抽提质粒，按酵母质粒提取试剂盒说明书操作以提取的酿酒酵母高活性突变体质粒为模板做克隆验证商业引物做正反向引物验证正确的突变体将提取的重组酿酒酵母质粒电转到大肠杆菌感受态细胞当平板上生长出单菌落时，挑取单克隆并接种至并将其重组到质粒上，取重组质粒电转入大肠杆菌感受态细胞，电击后加入液体培养基混匀，摇床中孵育，分别涂布于含有的固体平板抗性筛选，恒温培养箱倒臵过夜培养。

收集到的菌体用质粒小提试剂盒抽提质粒，按其说明书操作。

酿酒酵母的转化用载体法高效转化冷冻活性酵母细胞，具体操作步骤如下将配制好的从冰箱取出，沸水中煮，使其变性，取出后立即放入冰浴备用将载体进行漆酶基因的异源表达来提高表达量，都是目前解决问题的有效方法，。

转录调节序列突变库构建将实验室保藏的大肠杆菌划线于固体平板，挑取单克隆接种于液体培养基，并于的恒温摇床中过夜培养。

利用质粒小提试剂盒提取质粒，作为易错的模板，以调节区域为上游引物，其碱基序列为，调节区域为下游引物，其碱基序列为摘要为提高漆酶的表达量，本研究主要针对漆酶转录调节区域进行定向进化。

利用易错，选择不同浓度的对调节区域进行突变，并以酿酒酵母为宿主细胞进行异源表达，构建。

选用，联氮基双乙基苯并噻唑啉磺酸胺盐为底物的孔板测定漆酶酶活高通量筛选方法对突变库中株突变体进行筛选，并对酶活高的突变体进行摇瓶复筛，最终获得株遗传稳定性良好的酶活较高地突变体，其粗酶液酶活分别是野生型菌株粗酶液酶活的倍倍倍，突变菌磊，张志军灵芝漆酶研究进展食用菌，郑志强耐热性细菌漆酶的高效表达及其在纸浆生物漂白中的应用无锡江南大学，胡周月，钱磊，张志军，等漆酶在食品工业及其他领域上的应用进展天津农学院学报，马倩倩，赵丽红，陈威漆酶在环境保护中的应用研究进展工业安全与环保，宫瑾，黄振强，郑意，等提高酿酒酵母异源蛋白表达及分泌效率的研究进展汕头大学医学院学报，刘晓庆，那日，郭峰漆酶基因异源表达及其酶活性的研究进展安徽农业科学，董欣瑞，秦丽娜，陶勇，等糙皮侧耳，联氮乙基苯并噻唑磺酸购自公司其它试剂均为国产分析纯。

探讨定向进化转录调节基因在对漆酶异源表达的作用分子生物学论文。

图野生型和个优势突变体摇瓶复筛漆酶粗酶液酶活检测结果突变体序列测定及比对为测定个优势突变体中酶活最高的株菌株的碱基序列，首先抽提酵母质粒，并对其进行克隆，产物验证电泳图如图所示。

从图中可以看到条大小约为的清晰条带，说明酵母质粒提取成功。

之后将提取的重组酿酒酵母质粒电转到大肠杆菌中的高效表达及酶学性质微生物学报，曲戈，赵晶，郑平，等定向进化技术的最新进展生物工程学报，宁娜，谭慧军，孙新新，等真核生物来源漆酶的异源表达研究进展生物工程学报，李媛，张爱丽，周伟，等酿酒酵母基因工程菌的构建及工艺优化研究进展中国民族民间医药，田晓娟酵母表达系统研究概述陇东学院学报，陆梅鹏，朱小明，王亮助镀剂铁离子浓度对镀锌锌耗的影响研究山东化工，基金天津市海外留学择优资助项目。

材料与方法菌株和质粒大肠杆菌酿酒酵株突变库，利用以为底物的高通量的筛选方法对突变库进行筛选，并对酶活高的突变体进行摇瓶复筛，最终获得了株遗传稳定的高酶活突变体。

它们的突变均在启动子区域，说明启动子上的突变引起了漆酶表达量的提高。

通过定向进化转录调节区域，漆酶最高活性可达。

参考文献谭小珊，王帅杰，吴科元，等刺芹侧耳产漆酶条件优化及对偶氮染料甲基橙的脱色菌物学报，刘恋，杨清漆酶的研究进展及其应用山东化工，钱磊，张志军灵芝漆酶研究进展食用菌，郑志强耐热性细菌探讨定向进化转录调节基因在对漆酶异源表达的作用分子生物学论文漆酶在里氏木霉中的高效表达及酶学性质微生物学报，曲戈，赵晶，郑平，等定向进化技术的最新进展生物工程学报，宁娜，谭慧军，孙新新，等真核生物来源漆酶的异源表达研究进展生物工程学报，李媛，张爱丽，周伟，等酿酒酵母基因工程菌的构建及工艺优化研究进展中国民族民间医药，田晓娟酵母表达系统研究概述陇东学院学报，陆梅鹏，朱小明，王亮助镀剂铁离子浓度对镀锌锌耗的影响研究山东化工，基金天津市海外留学择优资助项目突变质粒转化酿酒酵母进行异源表达，构建酿酒酵母菌株突变库，利用以为底物的高通量的筛选方法对突变库进行筛选，并对酶活高的突变体进行摇瓶复筛，最终获得了株遗传稳定的高酶活突变体。

它们的突变均在启动子区域，说明启动子上的突变引起了漆酶表达量的提高。

通过定向进化转录调节区域，漆酶最高活性可达。

参考文献谭小珊，王帅杰，吴科元，等刺芹侧耳产漆酶条件优化及对偶氮染料甲基橙的脱色菌物学报，刘恋，杨清漆酶的研究进展及其应用山东化工，是目前解决问题的有效方法，。

探讨定向进化转录调节基因在对漆酶异源表达的作用分子生物学论文。

图野生型和个优势突变体摇瓶复筛漆酶粗酶液酶活检测结果突变体序列测定及比对为测定个优势突变体中酶活最高的株菌株的碱基序列，首先抽提酵母质粒，并对其进行克隆，产物验证电泳图如图所示。

从图中可以看到条大小约为的清晰条带，说明酵母质粒提取成功。

之后将提取的重组酿酒酵母质粒电转到大肠杆菌感受态细胞，接种单克隆培养，并抽提质粒，将质感受态细胞，接种单克隆培养，并抽提质粒，将质粒送公司测序，然后用软件整理测序结果，与原序列比对后，发现活性最高的个突变体在区域均有突变。

因此推断，个突变体上出现的个突变加强了启动子与聚合酶的结合，因此加速了漆酶基因的转录能力，从而引起漆酶表达量的提高。

图个优势突变体的酵母质粒菌落结果代表，代表突变体结论与展望本章通过对调节漆酶表达的调节区域进行突变，并将母菌株由本实验室保存，重组载体由本实验室构建。

酶和试剂基因购自公司质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司酵母质粒小提试剂盒无氨基酵母氮源购自公司。

胰蛋白胨酵母提取物购自英国公司琼脂糖购自公司漆酶的高效表达及其在纸浆生物漂白中的应用无锡江南大学，胡周月，钱磊，张志军，等漆酶在食品工业及其他领域上的应用进展天津农学院学报，马倩倩，赵丽红，陈威漆酶在环境保护中的应用研究进展工业安全与环保，宫瑾，黄振强，郑意，等提高酿酒酵母异源蛋白表达及分泌效率的研究进展汕头大学医学院学报，刘晓庆，那日，郭峰漆酶基因异源表达及其酶活性的研究进展安徽农业科学，董欣瑞，秦丽娜，陶勇，等糙皮侧耳漆酶在里氏木送公司测序，然后用软件整理测序结果，与原序列比对后，发现活性最高的个突变体在区域均有突变。

因此推断，个突变体上出现的个突变加强了启动子与聚合酶的结合，因此加速了漆酶基因的转录能力，从而引起漆酶表达量的提高。

图个优势突变体的酵母质粒菌落结果代表，代表突变体结论与展望本章通过对调节漆酶表达的调节区域进行突变，并将突变质粒转化酿酒酵母进行异源表达，构建酿酒酵母菌探讨定向进化转录调节基因在对漆酶异源表达的作用分子生物学论文定向进化漆酶漆酶异源表达酿酒酵母漆酶，是种含有个铜离子的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶家族，能够催化多种酚类和非酚类的化合物因此在造纸漂白，染料脱色，食品加工环境保护等领域有广阔的应用前景。

但是，自然界的野生菌漆酶存在酶活低产量低培养周期长高温易失活等问题，导致其难以应用于工业生产。

随着分子生物学和基因组学的迅猛发展，通过定向进化技术来提高漆酶表达量催化能力稳定性及底物特异性等寻找合适的载体进行漆酶基因的异源表达来提高表达量，都配制好的从冰箱取出，沸水中煮，使其变性，取出后立即放入冰浴备用将保藏的感受态细胞取出，放于水中，离心，去除上清，依次加入下列待转化的质粒及无菌水，总体积用移液器充分混匀，放于水浴离心，去除上清加入液体培养基重悬，放入水浴取重悬液涂布于平板，培养天，即可长出转化子。

摘要为提高，调节区域为下游引物，其碱基序列为。

反应体系，。

反应条件，共个循环。

每个小离心管装，放入液体培养基中，在条件下培养将培养的菌液用质粒小提试剂盒提取大肠质粒，测浓度并进行质粒验证，然后送至公司进行测序，将测序正确的菌株甘油冻存管储存在冰箱中。

漆酶高表达突变株调节区域序列比对将测序结果进行整理，与原始序列进行同源比对，该过程用软件完成，统计碱基突变位点。

探讨定向进化转录调节基因在对漆酶异源表达的作用分子生物学论文。

预培养基藏的感受态细胞取出，放于水中，离心，去除上清，依次加入下列待转化的质粒及无菌水，总体积用移液器充分混匀，放于水浴离心，去除上清加入液体培养基重悬，放入水浴取重悬液涂布于平板，培养天，即可长出转化子。

预培养基，值缓冲液，去离子水。

表达培养基。

反应体系，。

反应条件，共个循环。

每个小离心管装，放入仪，反应结束后，取产物利用核酸胶电