BMSCs外泌体抑制急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡（急性心肌梗死论文）㊣精品文档值得下载

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过表达及阴性对照慢病毒载体滴度，由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。

实验方法分离与培养取只大鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下剪去大鼠双侧股骨及胫骨骨骺端，暴露骨髓腔，采用注射器吸取含胎牛血清的培养基冲出骨髓，并反复吹打制外泌体抑制急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡急性心肌梗死论文只大鼠随机分为组组组组组和组，每组只。

腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，暴露大鼠颈部气管，气管插管连接呼吸机辅助呼吸，呼吸机参数呼吸频率为次，潮气量为，呼吸比为∶。

于大鼠胸部左侧第肋骨间手术切口，暴露心脏，在左冠状动脉前降支起始部，采用针线进行结扎，缺血处理后，剪开丝线恢复血流灌注。

当观察到心电图记录仪上段出现明显抬高，且左心室缺血变白，说明模型构建成功。

材料与方法实验材料及试剂只清洁级雄性大鼠，周龄，体质量为公司外泌体提取试剂盒购自美国公司膜购自美国公司凋亡检测试剂盒购自武汉博士德公司蛋白提取试剂购自上海生工生物公司鼠抗单克隆抗体鼠抗单克隆抗体鼠抗单克隆抗体均购自美国公司兔抗多克隆抗体兔抗多克隆抗体兔抗多克隆抗体兔抗多克隆抗体兔抗多克隆抗体及兔抗多克隆抗体均购自英国公司。

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滴加化学发光试剂，于暗室中曝光，读取条带灰度值。

流式细胞仪检测表面标志物收集第代生长状况良好的，经过消化处理后制成单细胞悬液，离心，调整细胞密度为个。

取细胞悬液，分别加入单抗，冰上避光孵育，洗涤次，加入重悬细胞，流式细胞仪进行检测。

成骨诱导分化收集第代生长状况良好的，按细胞密度为个接种于孔板中，待细胞融合度达到时加入成骨诱导液甘油磷酸钠地塞米松抗坏血酸，每换液次。

诱检测及水平收集细胞或外泌体或梗死交界区心肌组织，提取总，测量纯度。

将逆转录成，以为模板进行扩增。

以为内参，检测表达水平以为内参，检测水平。

引物序列如下，文献司红金，李丽丽骨髓间充质干细胞在心肌梗死中的应用中华老年心脑血管病杂志，凌浩，刘威武，侯秀伟，等间充质干细胞源性外泌体在心血管疾病中的研究进展国际心血管病杂志，李佳，辛毅，崔巍，等人脐带间充质干细胞外泌小体保护缺氧复氧损伤的心肌细胞中国病理生理杂志，林蓓佑，李平外泌体相关微在急性心肌梗死中的研究进展医学综述，常宏，田立茹，李佳凝，等信号通路在心力衰竭中的作用机制华北理工大学学报医学版曾良，万朝辉，周辉修饰的骨髓间充质干细胞外泌体抑制急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡中国急救医学，。

染色观察心肌梗死面积完外泌体更好地改善心脏功能，抑制心肌细胞凋亡。

为了进步探讨对的保护作用机制，通过网站预测发现与之间存在结合位点，是种重要的抑癌基因，可在心肌细胞中表达，在心肌梗死高血压及动脉粥样硬化等心血管疾病的发展过程中发挥重要作用。

当发生缺氧缺血或缺血再灌注损伤时，心肌细胞中基因的表达会明显增加，而信号通路激活可诱导心肌细胞凋亡，。

本研究结果显示，过表达外泌体治疗大鼠后，心肌组织中表达升高，而表达降低，提示可负调控，经过表达修饰的外泌体可能是通过下调大鼠心肌组伴随着心肌细胞的缺血缺氧凋亡坏死以及炎症反应等病理过程，对心脏功能造成不可逆的损伤，导致临床上常规药物或手术的治疗效果并不理想。

研究发现，干细胞移植，分化成心肌细胞可替代梗死心肌细胞，从而改善心脏功能。

干细胞移植为治疗策略的研究提供了新方向，而干细胞分泌的外泌体比干细胞本身具有更大的治疗价值，。

外泌体是种直径为的双层脂质膜囊泡，携带有多种蛋白质等大分子物质，外泌体传递至靶细胞，可对受损的心肌细胞起到改善和修复心肌功能的作用。

外泌体在心肌梗死中可发挥抗凋亡抗炎抗心肌重构等肌细胞凋亡率明显升高经外泌体干预后，心肌细胞凋亡率明显低于组，而与组比较，组心肌细胞凋亡改善效果更明显。

见图。

外泌体对大鼠心肌组织中及表达的影响与组比较，组心肌组织中表达明显降低，而表达明显升高与组比较，各来源外泌体干预组表达明显升高，表达明显降低与组比较，组表达上调表达下调更明显。

见图。

图染色观察外泌体抑制急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡急性心肌梗死论文成超声心动图监测后，每组随机取只大鼠，颈椎脱臼处死后，取其心脏，沿着心脏横轴方向进行切片，厚度约为，经染液避光染色，可观察到红色为正常心肌，白色为缺血梗死心肌，采用软件计算心肌梗死面积占切面总面积的百分比。

法观察心肌细胞凋亡分组干预后取剩余大鼠颈椎脱臼处死，取部分梗死交界区心肌组织，常规石蜡包埋后制备成组织切片，根据凋亡检测试剂盒说明书操作，在显微镜下拍照观察，于倍光镜下随机选取个视野，统计阳性细胞和总细胞数目，凋亡率阳性细胞数总细胞数。

外泌体抑制急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡急性心肌梗死论文体凋亡途径的激活，从而保护心肌细胞。

本研究中各来源外泌体干预组心肌组织中抗凋亡蛋白表达上调，和表达下调，过表达外泌体组上调及下调效果更明显，可能是因为抑制表达，影响了介导心肌细胞线粒体凋亡通路，这也解释了外泌体治疗后大鼠心肌细胞凋亡率降低的现象。

综上所述，修饰的外泌体作用于大鼠，可改善大鼠心脏功能，减少心肌梗死面积，抑制心肌细胞凋亡，其作用机制可能与靶向抑制激活线粒体凋亡途径相关。

参考果显示，与细胞裂解液比较，所提取物质中外泌体特异性表达标志物和高表达，而细胞裂解液中未检测到和蛋白表达见图。

表明成功分离获得分泌的外泌体。

图大鼠外泌体形态观察及特异性蛋白表达检测图流式检测大鼠表面标志物和的表达慢病毒转染后各组及其外泌体中表达水平经过表达慢病毒载体转染后，组及组中表达水平明显升高，见图和，表明转染实验成功，获得高表达的及其外泌体。

图检测大鼠织中的表达，抑制心肌细胞的凋亡。

图大鼠心肌组织中和蛋白表达水平比较线粒体介导的内源性凋亡途径是细胞凋亡的主要机制之，通过激活线粒体凋亡途径促进心肌细胞凋亡，还可导致线粒体功能障碍，促进心力衰竭发生。

家族在线粒体凋亡途径中发挥关键性作用，通过靶向调控家族蛋白的表达，降低线粒体膜电位，增加膜通透性，从而使线粒体内的细胞色素被释放，触发凋亡反应，引起心肌细胞凋亡，。

等实验结果也证实了通过介导相关线粒体凋亡途径调节心肌细胞凋亡，抑制可降低线粒作用，其中来源于的外泌体中富含可起到抗细胞凋亡作用。

等研究结果显示，可促进心肌细胞自噬和抑制凋亡，从而发挥保护心肌损伤的作用。

因此，上调大鼠心肌组织中的表达，通过其抑制心肌细胞凋亡作用可能对心肌缺血再灌注损伤有所保护。

本研究成功构建大鼠模型，经外泌体干预后，大鼠心脏功能得到改善，心肌梗死面积减少，心肌细胞凋亡水平降低，而过表达外泌体组干预后的改善效果更明显，提示来源外泌体移植治疗在缺血再灌注损伤中具有较好的治疗作用，且过表达修饰的外泌体比未经修饰的大鼠心肌细胞凋亡图大鼠心肌组织中和水平比较过表达的外泌体对大鼠心肌组织中凋亡相关蛋白表达的影响与组比较，组心肌组织中表达明显降低，及蛋白表达明显升高与组比较，各来源外泌体干预组表达明显升高，及蛋白表达明显降低与组比较，组表达进步升高，及表达进步降低，差异均有统计学意义。

见图。

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见表。

表各组大鼠心脏功能及心肌梗死面积比较过表达的外泌体对大鼠心肌细胞凋亡的影响与组比较，组心外泌体抑制急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡急性心肌梗死论文轴方向进行切片，厚度约为，经染液避光染色，可观察到红色为正常心肌，白色为缺血梗死心肌，采用软件计算心肌梗死面积占切面总面积的百分比。

图大鼠成骨诱导后茜素红染色观察外泌体鉴定经透射电子显微镜扫描显示，可观察到直径的囊泡见图结表达水平以为内参，检测水平。

引物序列如下，。

反应条件变性，退火，延伸成单细胞悬液。

加入等体积的分离液，离心，收集中间细胞层于新离心管中。

洗涤，离心，再加入完全培养基悬浮细胞，并接种于细胞培养瓶中，于培养箱中培养，换液次，待细胞融合度达以上时进行∶传代培养。

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