注为的，泳道母本，泳道父本，其余泳道为样本条带第三章结果与分析图引物对田间杂株分析聚丙烯酰胺凝胶电泳注为的，泳道父本，泳道母本，为样本条带从图可以看出，田间鉴定的杂株取样进行带型分析，发现仅有株不育系为杂株，其余的都是共有父本和母本的条带，跟盐两优的带型相同，但是与田间鉴定出的杂株类型有差别，无法明显区分异品种和变异株，所以进步采用的非变性的聚丙烯胺酰胺凝胶电泳进行分析，如图泳道为混杂的母本杂株，其余的为异品种或者变异株，如图泳道为与不育系带型致的杂株，确定为不育系混杂，没有发现有父本种子混杂，其余的杂株为异品种和变异株。采用两种引物和检测田间杂株，关于混杂父本母本异品种或变异株检测结果吻合。湖北大学硕士学位论第四章讨论纯度鉴定模板的提取及影响阳性率因素本实验采用热碱法快速抽提作为模版时，常常遇到定比例阴性，在其他条件相同的情况下，产物量取决于模板的浓度与质量，当用法和热碱快抽法两种方法提取的模板添加量相同时，由于法提取的模板浓度要高于热碱快抽法，所以实际的扩增过程中，扩增的产物量也会相应的增加。通过增加模板热碱快抽法提取的添加量而增加了底物的反应几率，从而很好的弥补了热碱快抽法提取质量不高的不足，在实际大批量的纯度检测应用中，采用热碱快抽法获取模板就可以满足本实验的纯度鉴定需求，完全可以用省时省力的热碱快抽法取代费时操作繁琐的法。本文希望得到种适用于水稻纯度鉴定的快速高效的检测方法，为了适应农作物实际生产的需要，在保证结果可靠的基础上，节省检测时间。选取不同浓度或者不同抽提方法提取的基因组作为模版进行实验，因为快抽法的模板质量毕竟及不上法提取的模板，如果出现极个别热碱快抽法的模板质量偏低，则会导致检测的产物量偏低，染色后条带依然偏淡，会使观察效果因人而异，由于杂交稻会扩增出两条带，而其中条带因为实验染色，电泳等因素导致其中条带显色不明显，会误以为是杂株条带或是没有扩增，通过优化反应体系包括退火温度延伸时间变性时间。本实验在使用快抽法提取模板时应使反应液充分与样本接触以保证提取效率，经改善各实验环节后反应成分添加量电泳条件染色条件等不仅减少了杂带的产生，还保证了产物的扩增量。鉴定结果的差异性探讨鉴定杂株类型时，如果只用对引物，则不易区分出其他类型的杂株异品种杂交稻，但是通过田间观察却可以发现这些杂株，故而纯度高于田间的纯度也是很正常的。田间鉴定也主要以表型判断为根据，而表型是环境和基因型相互作用的结果，人为判断有定的难度，不同的鉴定者会因经验观察习惯的不同而造成鉴定结果难做到致，因此田间鉴定存在误差是不可避免的。用筛选出的对引物分别进行纯度鉴定时鉴定结果不完全致，对田间杂株取样进行分析，发现部分杂株扩增的条带与母本致琼脂糖凝胶电泳，其余的杂株共有父本和母本的条带，与真实的盐两优所扩增条带没有表现出差异性，但这些共有双亲条带的杂株在田间却可以鉴别出来，仅通过琼脂糖凝胶电泳却无法直接分辨，究第四章讨论其原因是可能有以下几点是混杂了其他亲缘性相近的杂交品种，这些异品种在些位点上扩增出与盐两优相同或相近大小的片段，或者是异品种与盐两优在些位点上本身就没有差异性，需要进行多位点检测才可以进步区分，而相同或相近片段无法在琼脂糖凝胶上体现出多态性二是检测出了跟不育系相同带型的杂株，初步认定为混杂的不育系，但是也有可能是检测的为点数太少，混杂了其他不育系异品种，而异品种在些位点上表现出与不育系相同的带型，需要检测多个位点才能区分，这无疑增加了纯度鉴定的难度与成本三是在采用的亲本种子在其亲本选育过程中自身产生了变异，导致些子代在进行检测时所扩增的条带与亲本条带对比会出现细微的差别四是。为了具体分析以上细微的差别，本实验进步采用分辨率更高的的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来代替琼脂糖凝胶电泳对田间杂株的条带进行分析，结果不仅验证了田间杂株鉴定结果的可靠性，还区分了杂株类型，本实验采用两种引物对田间杂株进行鉴定后，采用聚丙烯胺酰胺凝胶电泳分析时均未发现有父本混杂，说明了盐两优制种收割父本时严格按照了程序执行，没有将恢复系漏割与制种田不育系混杂。样本植株的大小和发芽率对纯度鉴定的影响室内鉴定与田间鉴定所选用的时期不致，实验室所采用鉴定采用幼叶提取进行分析，而田间鉴定则主要集中在成苗期或者抽穗期阶段进行。从模板提取过程来看，两种方法有可能受发芽率的干扰而影响实验者的抽样。就杂交水稻而言，杂株的数量只占极少数，以混杂不育系为主，相对于杂交水稻而言其亲本种子的发芽势弱，且发芽率较低，这些混杂的亲本种子最终能否正常发芽并被播种或者是否被正常抽样将直接影响纯度鉴定结果。同样的室内鉴定时，混杂的亲本或者其他的杂种也会因为发芽势不致的而造成样本单株的改变，导致实验者在抽样时因为选择习惯上的习惯抽取幼苗长势好而漏掉矮小的幼苗，而矮小的幼苗有极有可能是混杂的亲本，造成实验结果的不准确。因此，在保证发芽率的情况下确定最佳样本数量，使田间小区种植鉴定与鉴定结果尽可能致，为生产上用鉴定替代田间种植鉴定降低成本提高效率，更好地适应种子供求贸易节奏的需求，服务于我国的农业生产。标记鉴定的最小样品量本实验结合田间社区种植鉴定和标记鉴定发现盐两优的纯度都在以上，由于纯度鉴定的取样具有随机性，那么很有可能会出现选择样本数量过少，导致无法检湖北大学硕士学位论测出杂株，而鉴定样本数太多时无疑会增加鉴定的工作量和成本。本实验采用种多态性引物针对不同的样品数量进行检测，最终确定了样本数量为的纯度鉴定。对比分子检测结果跟孝感海南两处田间调查结果发现这两种鉴定方法的结果没有明显的差异性，证明了采用分子标记技术鉴定纯度的可靠性与可行性。标记是种基于分子操作水平上的鉴定，对于熟练的实验操作者而言鉴定结果准确可靠。但分子标记的本质是扩增，因此在实际操作过程中采集样品提取对应编号数据记录图片观察统计等都需要做到认真仔细，以保证纯度鉴定结果的可靠性。扩增结果存在的定比例的阴性也是值得注意，因为本实验采用热碱快抽法的模板，那么会存在极个别样本在抽提过程中提取液与样本没有充分接触或者受热不均匀不充分使模板最低限度浓度无法得到保证，从而导致扩增没有目的产物生成或者产物生成量很少无法用直接目测观察到，所以在用热碱快抽法获取模板的过程中应保证样品尽可能的剪碎样本沉积在管最底部，再者高效的酶和适宜的退火温度是使扩增产物具有特异性的重要保证，这样的鉴定结果才是可信的。所以在选用引物时，最宜选用扩增条带尽可能的简单父本和母本最好各条带便于观察统计扩增条件不敏感样品扩增的实验操作可重复性强的引物。本研究利用分子标记技术鉴定盐两优种子纯度，以期建立套适合该品种纯度鉴定的技术规程，在操作流程中应注意以下几点在对盐两优的取材浸种催芽的幼苗过程中，定要遵循随意取材的原则，不可主观性的只取生长旺盛高大的幼苗在浸种催芽过程中防止种子间相互挤压，种子间相互挤压会使部分谷粒的长势出现滞后的现象，应使种子均匀分散开来在使用热碱快抽法提取模板时使样本充分剪碎，保证提取液与样本充分接触以提取更多的模板使用琼脂糖凝胶电泳时，上样量不宜超过，上样量过大会使部分产物出现滞后现象，使带型变宽，干扰带型分析，上样量低于时会使看不清条带纯度鉴定的样本数量以为宜，个样本的鉴定结果便可满足该品种的纯度鉴定。参考文献参考文献赵虹，徐国华，廖芳丽分子标记技术在杂交水稻种子纯度鉴定中的作用湖北农业科学邹江石，吕川根水稻超高产育种的实践与思考作物学报郑智强浅谈杂种优势作物学报廖新英对加强种子质量管理的几点看法福建稻麦科技熊扣华，李成，张赛等大面积水稻高产增收成效与措施大麦与谷类科学吴毓，王培华，杨德等杂交水稻强优势组合的选配原则机栽培技术南方农业曹存玉杂交水稻种子纯度南繁鉴定存在的问题及对策中国种业杨薇，候佐，木卜文如何做好小麦田间小区种植鉴定种子科技刘桃菊，殷新佑，戚昌瀚气候变化与水稻生长发育及产量形成关系的模拟研究应用生态学报陆永法，马荣荣，王晓燕等甬优系列杂交水稻标记指纹图谱和籼粳属性中国水稻科学，，，，，，湖北大学硕士学位论，，，，，薛达元转基因生物安全性与管理北京科学出版社，，