采用发酵法生产抗菌肽。

月抗菌肽分离和纯化。

月抗菌肽抗菌活性和抗菌谱测定。

年月含抗菌肽饲料配制。

月动物实验。

月课题总结鉴定。

项目经费预算情况项目投资总额项目已完成投资项目须新增投资及投资构成和投资预算申请科技三项经费使用预算见附表。

申请经费总额万元。

其中仪器设备购置费万元材料样品费万元试验费检测费万元资料调研费万元鉴定费万元。

三项目实施支撑条件项目技术来源课题申请人在法国国家农业研究中心分子遗传学实验室工作期间，参加了欧盟资助有关微生物抗菌肽在解脂耶氏酵母中表达研究课题，掌握了抗菌肽研究相关技术，为本课题顺利完成奠定了技术基础。

项目实验检测条件申请人所在实验室为江西省生物化学与分子生物学重点实验室，具有全自动测序仪型型电转仪高速冷冻离心机超速冷冻离心机超低温冰箱仪，超纯水系统各种规格电泳仪杂交仪紫外分光光度计设施先进细菌培养室等仪器设备。

上述仪器设备基本上可满足本项目研究需要。

项目申请单位人才资源情况技术人员总数中高级技术人员比例项目申请单位南昌大学是我省唯所省部共建工程重点建设大学，人才资源丰富，科研力量雄厚。

生命科学学院有专任教师人，其中正副教授人，讲师人，中高级技术人员比例。

项目组人员专业结构职称结构项目组科研人员人，主要由生物化学与分子生物学专业微生物学专业人员组成，专业结构合广谱抗菌能力抗菌肽，并将其制成抗菌肽制剂。

研究成果实用性强，易于转化。

在产品研制工抗菌肽基因，但并未对该基因表达及其产物抗菌活性进行分析，也没有开发出基于鱼类抗菌肽基因广谱抗菌肽制剂。

本项目将开发出具有自主知识产权新型抗菌肽制剂。

项目完成时至少可达到国内领先水平。

项目技术方案论述生产技术工艺流程主要技术参数将采用技术从鱼类克隆抗菌肽全长基因与表达载体连接构建重组载体重组载体转入酵母筛选抗菌肽高效表达酵母体系大量表达抗菌肽抗菌肽抗菌活性和抗菌谱测定抗菌肽作为饲料添加剂进行动物实验重组表达载体构建将我们从淡水鱼中诱导表达抗菌肽基因与具有高效表达启动子表达载体连接，构建重组表达载体。

抗菌肽基因酵母表达体系构建及高效表达系统筛选采用醋酸锂法将重组载体转入解脂耶氏酵母，构建抗菌肽基因酵母表达系统。

采用法和法从转录和翻译两个水平上筛选抗菌肽高效表达酵母。

抗菌肽大量表达。

利用筛选到高效表达酵母菌发酵产生抗菌肽。

抗菌肽分离纯化。

离心收集表达上清液，采用硫酸铵沉淀抗菌肽。

经层析，收集各个洗脱峰，用分析鉴定目多肽所在峰。

将含有目多肽洗脱液用透析，冻干浓缩。

多肽于保存，用于分析鉴定及生物功能试验。

抗菌肽抗菌活性和抗菌谱测定。

采用琼脂扩散纸片法。

以大肠杆菌沙门氏菌，肠球菌链球菌分枝杆菌巴氏杆菌布鲁氏菌弧菌痢疾杆菌绿脓杆菌梭状芽孢杆菌李氏杆菌巨大芽孢杆菌醋酸钙不动杆菌金黄色葡萄球菌化脓链状球菌流感病毒疱疹病毒为受抑菌。

将大肠杆菌等受抑菌培养后分别加入到平皿中，用玻璃刮铲将菌液涂布均匀，再将浸透被测样品液滤纸片放在培养基表面，标记后置于穿孔，使细胞质外溢而达到杀菌目。

由于抗菌肽与细菌细胞膜结合不需要膜上特定受体，因此不会诱导产生抗药菌株和交叉抗性，有望给临床医学药学食品加工动物和植物转基因技术等领域带来广阔开发应用前景。

鱼类生活在水环境中。

由于环境破坏，自然水体和养殖水体污染日益严重，水体中病源微生物种类和含量在不断增加。

面对复杂生存环境，鱼类在生存过程中需要不断地同大量病原微生物作斗争。

但是，由于鱼类没有或淋巴细胞，体液因子中也没有免疫球蛋白存在，在消灭入侵微生物时，抗菌肽就起到了至关重要作用。

因此，鱼类先天免疫系统中极有可能存在高效广谱生物抗菌肽。

我们在前期工作中克隆了高效广谱鱼类抗菌肽基因，本项目拟通过酵母表达获得抗菌肽，并将抗菌肽添加到饲料中，为日益严重鱼类和畜禽病害防治开辟新途径。

项目所处技术领域技术发展现状由于抗菌肽具有独特抗菌机制，广谱杀菌作用，高效抗菌活性以及靶菌株难以产生抗性等优点，因此有着广阔开发应用前景，是目前国际学术研究活跃领域之。

计算机检索表明，国外科学家作了大量工作，对抗菌肽研究已经取得了许多进展。

法国科学家蒂马克先生于年月创建了公司，目是尽可能得到不同类型抗菌肽分子。

迄今国外科学家已在不同生物中发现了多种抗菌肽，我国在抗菌肽研究方面起步较晚，仅有少量报道。

大量结果显示不同抗菌肽其抗菌活性和抗菌谱存在很大差异，因此继续寻找高效广谱生物抗菌肽，是广大生命科学工作者努力方向。

项目技术先进性，对相关领域技术进步推动作用本项目采用是先进分子生物学研究技术。

用基因克隆技术将我们从鱼肝脏中分离抗菌肽基因与具有高效表达启动子表达载体连接，构建重组分子。

然后用醋酸锂法将重组分子转入解脂耶氏酵母中，筛选高效表达抗菌肽工程菌，以工程菌工业化发酵生产抗菌肽，进而开发出高效广谱新型抗菌剂。

该项目实施对相关领域技术进步有定推动作用。

项目目前进展情况。

我们已进行了前期工作，用引起人畜共患病多种微生物诱导鱼，继而采用差异显示技术从经微生物诱导鱼肝脏中分离到了三个特异表达分子，并使用技术克隆了它们全长基因。

这些工作为本项目实施奠定了基础。

二技术方案论述项目技术关键点或创新点论述，项目完成时达到技术水平目前，人们主要以两种方法获得抗菌肽。

其是直接从生物体内分离抗菌肽，用这种方法不能获得大量抗菌肽。

其二是根据已发现抗菌肽基因序列设计引物在不同生物中通过技术克隆抗菌肽基因，该方法只能在不同生物中获得该抗菌肽同源基因，而不能获得新抗菌肽基因。

在本项目中，我们将前期工作中获得抗菌肽基因与载体连接，构建抗菌肽酵母高效表达体系，以工程菌工业化发酵生产抗菌肽，用这种方法可获得大量新高效广谱抗菌肽。

计算机检索结果表明，人们对昆虫抗菌肽进行了较多研究，而对鱼类抗菌肽研究很少。

目前国内只有厦门大学最近采用传统方法从海水养殖鲈鱼中分离出种抗菌肽基因，但并未对该基因表达及其产物抗菌活性进行分析，也没有开发出基于鱼类抗菌肽基因广谱抗菌肽制剂。

本项目将开发出具有自主知识产权新型抗菌肽制剂。

项目完成时至少可达到国内领先水平。

项目技术方案论述生产技术工艺流程主要技术参数将采用技术从鱼类克隆抗菌肽全长基因与表达载体连接构建重组载体重组载体转入酵母筛选抗菌肽高效表达酵母体系大量表达抗菌肽抗菌肽抗菌活性和抗菌谱测定抗菌肽作为饲料添加剂进行动物实验重组表达载体构建将我们从淡水鱼中诱导表达抗菌肽基因与具有高效表达启动子表达载体连接，构建重组表达载体。

抗菌肽基因酵母表达体系构建及高效表达系统筛选采用醋酸锂法将重组载体转入解脂耶氏酵母，构建抗菌肽基因酵母表达系统。

采用法和法从转录和翻译两个水平上筛选抗菌肽高效表达酵母。

抗菌肽大量表达。

利用筛选到高效表达酵母菌发酵产生抗菌肽。

抗菌肽分离纯化。

离心收集表达上清液，采用硫酸铵沉淀抗菌肽。

经层析，收集各个洗脱峰，用分析鉴定目多肽所在峰。

将含有目多肽洗脱液用透析，源利用情况以工程菌工业化发酵生产抗菌肽，可大规模生产，生产周期短，生产成本低且不受季节和气候变化等外在环境影响。

工程菌发酵原料易得，不会破坏和浪费农业资源。

对人才培养情况本课题实施将为我国培养名生物化学和分子生物学及微生物学专业硕士研究生。

环境影响及效益。

以工程菌工业化发酵生产抗菌肽，在生产和推广应用过程中均不会影响生态环境。

抗菌肽基因，但并未对该基因表达及其产物抗菌活性进行分析，也没有开发出基于鱼类抗菌肽基因广谱抗菌肽制剂。

本项目将开发出具有自主知识产权新型抗菌肽制剂。

项目完成时至少可达到国内领先水平。

项目技术方案论述生产技术工艺流程主要技术参数将采用技术从鱼类克隆抗菌肽全长基因与表达载体连接构建重组载体重组载体转入酵母筛选抗菌肽高效表达酵母体系大量表达抗菌肽抗菌肽抗菌活性和抗菌谱测定抗菌肽作为饲料添加剂进行动物实验重组表达载体构建将我们从淡水鱼中诱导表达抗菌肽基因与具有高效表达启动子表达载体连接，构建重组表达载体。

抗菌肽基因酵母表达体系构建及高效表达系统筛选采用醋酸锂法将重组载体转入解脂耶氏酵母，构建抗菌肽基因酵母表达系统。

采用法和法从转录和翻译两个水平上筛选抗菌肽高效表达酵母。

抗菌肽大量表达。

利用筛选到高效选题必要性项目所处技术领域产业政策自从青霉素被发现以来，人们对病原菌引起感染性疾病不再束手无策，特别是内酰胺类抗生素发现，对病原菌感染性疾病治疗产生了革命性飞跃，抗生素已成为临床治疗病原菌感染强有力武器。

但是，随着抗菌药物广泛应用和滥用，耐药菌株不断增加，使抗感染治疗陷入耐药菌危机之中。

为了应对耐药菌感染，人们方面对传统抗生素进行结构改造以降低细菌耐药性，另广方面正在不断研究和开发新型抗菌药物。

近年来出现抗菌肽就是类具有巨大发展潜力新型抗菌药物，它是宿主产生类抵抗外界病原体感染小分子阳离子肽，广泛存在于昆虫植物动物及人体内，具有非特异性抗细菌真菌病毒等病原体作用，还有抗肿瘤细胞作用，因此又称为肽抗生素。

抗菌肽抗菌谱广，对多重耐药菌肿瘤细胞艾滋病毒有杀伤作用，甚至还可能有抗重症急性呼吸综合征，病毒作用。

因此有着广阔开发应用前景，是目前国际学术研究活跃领域之。

抗菌肽抗菌机制与传统抗生素不同，传统抗生素是与病原体特定部位受体结合从而使病原体正常结构遭到破坏或使些生物合成受阻，以达到抑菌或杀菌作用，当抗生素作用靶位点发生改变时，抗生素就会失去其抗菌作用，病原微生物往往通过基因突变改变抗生素靶位点而产生对抗生素有抗性耐药菌株抗菌肽对病原体作用则完全是物理作用。

由于抗菌肽具有疏水和亲水两亲性特征，通过其双亲性正电荷与细胞膜磷脂分子上负电荷形成静电吸附而结合在细胞磷脂膜上，随后抗菌肽分子疏水端插入细菌细胞膜脂质膜中，进而造成细胞膜穿孔，使细胞质外溢而达到杀菌目。

由于抗菌肽与细菌细胞膜结合不需要膜上特定受体，因此不会诱导产