。其是直接从生物体 内分离抗菌肽，用这种方法不能获得大量的抗菌肽。其二是根据 已发现的抗菌肽基因的序列设计引物在不同的生物中通过技 术克隆抗菌肽基因，该方法只能在不同生物中获得该抗菌肽的同 源基因，而不能获得新的抗菌肽基因。在本项目中，我们将前期 工作中获得的抗菌肽基因与载体连接，构建抗菌肽酵母高效表达 体系，以工程菌工业化发酵生产抗菌肽，用这种方法可获得大量 新的高效广谱抗菌肽。 计算机检索结果表明，人们对昆虫抗菌肽进行了较多的研究， 而对鱼类抗菌肽研究很少。目前国内只有厦门大学最近采用传统 方法从海水养殖的鲈鱼中分离出种抗菌肽基因，但并未对该基因的表达及其产物的抗菌活性进行分析，也没有开发出基于鱼类 抗菌肽基因的广谱抗菌肽制剂。本项目将开发出具有自主知识产 权的新型抗菌肽制剂。 项目完成时至少可达到国内领先水平。 项目技术方案论述生产技术工艺流程主要技术 参数 将采用技术从鱼类克隆的抗菌肽全长基因与表达载 体连接构建重组载体重组载体转入酵母筛选抗菌肽高效 表达酵母体系大量表达抗菌肽抗菌肽的抗菌活性和抗菌谱测 定抗菌肽作为饲料添加剂进行动物实验 重组表达载体的构建 将我们从淡水鱼中诱导表达的抗菌肽基因与具有高效表达启动 子的表达载体连接，构建重组表达载体。 抗菌肽基因酵母表达体系的构建及高效表达系统的筛选 采用醋酸锂法将重组载体转入解脂耶氏酵母，构建抗菌肽基因 酵母表达系统。采用法和法从转录和翻译两个水 平上筛选抗菌肽高效表达酵母。 抗菌肽的大量表达。 利用筛选到的高效表达酵母菌发酵产生抗菌肽。 抗菌肽的分离纯化。 离心收集表达上清液，采用硫酸铵沉淀抗菌肽。经 层析，收集各个洗脱峰，用的分析鉴定目的多肽 所在的峰。将含有目的多肽的洗脱液用透析，冻干浓缩。多肽于 保存，用于分析鉴定及生物功能试验。 抗菌肽的抗菌活性和抗菌谱测定。 采用琼脂扩散纸片法。以大肠杆菌沙门氏菌，肠球菌链球菌 分枝杆菌巴氏杆菌布鲁氏菌弧菌痢疾杆菌绿脓杆菌梭 状芽孢杆菌李氏杆菌巨大芽孢杆菌醋酸钙不动杆菌金黄 色葡萄球菌化脓链状球菌流感病毒疱疹病毒为受抑菌。将大 肠杆菌等受抑菌培养后分别加入到平皿中，用玻璃刮铲将菌液涂布 均匀，再将浸透被测样品液的滤纸片放在培养基的表面，标记后置 于恒温箱中培养，观察抑菌效果，测定抑菌圈直径，了解抗菌肽的抗菌谱。 将抗菌肽作为饲料添加剂进行动物实验。 项目技术质量指标项目产品达到的主要技术性能指 标执行的质量标准通过的国家相关行业许可认证等 项目达到的目标 构建出抗菌肽酵母高效表达体系，大量表达抗菌肽。 研制出具有自主知识产权的高效广谱的抗菌肽制剂。 考核指标 该酵母表达体系对抗菌肽的表达稳定，表达量的重复性 。 抗菌肽的抗菌活性高，抗菌谱广。 分阶段描述项目执行过程中各阶段目标 年 月将抗菌肽基因与具有高效表达启动子的表达载体 连接，构建重组表达载体。月将重组载体转入解脂耶氏酵母，构建抗菌肽基因 酵母表达系统。 月筛选高效表达抗菌肽的酵母系统。 月酵母发酵条件的优化。 年 月采用发酵法生产抗菌肽。 月抗菌肽的分离和纯化。 月抗菌肽的抗菌活性和抗菌谱测定。 年 月含抗菌肽饲料的配制。 月动物实验。 月课题总结鉴定。 项目经费预算情况项目投资总额项目已完成投资 项目须新增投资及投资构成和投资预算申请科技三项经费的 使用预算见附表。 申请经费总额万元。其中仪器设备购置费万元材料样品费李氏杆菌巨大芽孢杆菌醋酸钙不动杆菌金黄 色葡萄球菌化脓链状球菌流感病毒疱疹病毒为受抑菌。将大 肠杆菌等受抑菌培养后分别加入到平皿中，用玻璃刮铲将菌液涂布 均匀，再将浸透被测样品液的滤纸片放在培养基的表面，标记后置 于恒温箱中培养，观察抑菌效果，测定抑菌圈直径，了解抗菌肽的抗菌谱。 将抗菌肽作为饲料添加剂进行动物实验。 项目技术质量指标项目产品达到的主要技术性能指 标执行的质量标准通过的国家相关行业许可认证等 项目达到的目标 构建出抗菌肽酵母高效表达体系，大量表达抗菌肽。 研制出具有自主知识产权的高效广谱的抗菌肽制剂。 考核指标 该酵母表达体系对抗菌肽的表达稳定，表达量的重复性 。 抗菌肽的抗菌活性高，抗菌谱广。 分阶段描述项目执行过程中各阶段目标 年 月将抗菌肽基因与具有高效表达启动子的表达载体 连接，构建重组表达载体。月将重组载体转入解脂耶氏酵母，构建抗菌肽基因 酵母表达系统。 月筛选高效表达抗菌肽的酵母系统。 月酵母发酵条件的优化。 年 月采用发酵法生产抗菌肽。 月抗菌肽的分离和纯化。 月抗菌肽的抗菌活性和抗菌谱测定。 年 月含抗菌肽饲料的配制。 月动物实验。 月课题总结鉴定。 项目经费预算情况项目投资总额项目已完成投资 项目须新增投资及投资构成和投资预算申请科技三项经费的 使用预算见附表。 申请经费总额万元。其中仪器设备购置费万元材料样品费万元试验费检测费万元资料调研费 万元鉴定费万元。 三项目实施支撑条件 项目技术来源 课题申请人在法国国家农业研究中心分子遗传学实验室工作 期间，参加了欧盟资助的有关微生物抗菌肽在解脂耶氏酵母中表达 的研究课题，掌握了抗菌肽研究的相关技术，为本课题的顺利完成 奠定了技术基础。 项目实验检测条件 申请人所在实验室为江西省生物化学与分子生物学重点实验 室，具有全自动测序仪型 型电转仪高速冷冻离心机超速冷冻离心机超低温 冰箱仪，超纯水系统各种规格的电泳仪杂交仪 紫外分光光度计设施先进的细菌培养室等仪器设备。 上述仪器设备基本上可满足本项目的研究需要。 项目申请单位人才资源情况技术人员总数中高级 技术人员比例 项目申请单位南昌大学是我省唯所省部共建的工程重 点建设大学，人才资源丰富，科研力量雄厚。生命科学学院有专任教 师人，其中正副教授人，讲师人，中高级技术人员比例。 项目组人员专业结构职称结构 项目组科研人员人，主要由生物化学与分子生物学专业微生 物学专业人员组成，专业结构合理。科研人员中，教授人副教授 人助教人研究生人。其中具有博士学位的教师人。 项目新增投资筹集情况 本项目申请科研经费万元。 四项目预期经济效益 预期市场需求 由于抗菌药物的广泛应用和滥用，耐药菌株不断增加，对人类和动物的健康造成了严重威胁。抗菌肽杀菌力强，抗菌谱广，不良 反应少，不诱导产生耐药菌株，因此，必将成为今后抗菌药物的主 导产品。目前，国内还没有高效广谱抗菌肽产品面市，开发抗菌肽 前景广阔。 预期盈利水平 该技术的推广可产生明显的经济效益。 预期产业化前景 本项目以现代生物技术方法研制具有较强的广谱抗菌能力的抗菌 肽，并将其制成抗菌肽制剂。研究成果的实用性强，易于转化。在产 品的研制工作中采用了现代分子生物学新技术，产品的科技含量高， 生产成本低，利润空间大。本产品的生产不需特殊大型设备，产品定 型后可向中小型生化试剂生产企业转让，因此，本项目的产业化前景 广阔。我省具有定生产能力的试剂生产企业经技术培训后可生产本 产品。 项目实施风险分析。 本项目从生活在病原菌含量高的水体中的鱼类中寻找动物内 源性抗菌物质，以现代生物技术方法研制具有较强的广谱抗菌能力 的抗菌肽，并将其替代抗生素作为新型饲料抗菌添加剂。与传统抗 生素相比，抗菌肽杀菌力强，抗菌谱广，而且不会诱导产生耐药菌 株，因此具有强劲的市场竞争优势。 本产品为现代生物技术产品，技术含量高，生产成本底，投资 风险小。 五项目预计社会效益环境效益 对社会发展的作用 抗菌肽是类具有巨大发展潜力的新型抗菌药物，具有非特 异性抗细菌真菌病毒等病原体作用，还有抗肿瘤细胞作用，因 此又称为肽抗生素。抗菌肽抗菌谱广，对多重耐药菌肿瘤细胞 艾滋病毒有杀伤作用，甚至还可能有抗重症急性呼吸综合征 ，病毒的作用。因此 对社会发展具有重要的作用。 对资源利用情况 以工程菌工业化发酵生产抗菌肽，可大规模生产，生产周期短， 生产成本低且不受季节和气候变化等外在环境的影响。工程菌发酵 原料易得，不会破坏和浪费农业资源。 对人才培养情况 本课题的实施将为我国培养名生物化学和分子生物学及微 生物学专业的硕士研究生。 环境影响及效益。 以工程菌工业化发酵生产抗菌肽，在生产和推广应用过程中均 不会影响生态环境。 选题的必要性 项目所处技术领域产业政策 自从青霉素被发现以来，人们对病原菌引起的感染性疾病不 再束手无策，特别是内酰胺类抗生素的发现，对病原菌感染性 疾病的治疗产生了革命性飞跃，抗生素已成为临床治疗病原菌感 染的强有力武器。但是，随着抗菌药物的广泛应用和滥用，耐药 菌株不断增加，使抗感染治疗陷入耐药菌危机之中。为了应对耐 药菌感染，人们方面对传统抗生素进行结构改造以降低细菌的 耐药性，另方面正在不断研究和开发新型抗菌药物。近年来出 现的抗菌肽就是类具有巨大发展 潜力的新型抗菌药物，它是宿主产生的类抵抗外界病原体感染 的小分子阳离子肽，广泛存在于昆虫植物动物及人体内，具 有非特异性抗细菌真菌病毒等病原体作用，还有抗肿瘤细胞 作用，因此又称为肽抗生素。抗菌肽抗菌 谱广，对多重耐药菌肿瘤细胞艾滋病毒有杀伤作用，甚至还可能有抗重症急性呼吸综合征 ，病毒的作