激动剂预处理后，蛋白表达下降，但仍高于组拮抗阿片受体后，蛋白表达再次增高蛋白表达较组增高给予阿片受体激动剂预处理后，蛋白表达下降，但仍高于组拮抗阿片受体后，蛋白表达再次增高。阿片受体与之间可能存在的些相互作用，影响了下游的入核。野生型小鼠血清水平与前期实验结果基本致，然而由于缺失的小鼠炎症相关信号通路的失活，在肝脏损伤后，各处理组血清苏州大学硕士学位论文水平变化不明显阿片激动剂预处理能够部分抑制从核内释放出来，拮抗阿片受体能够翻转这种效应。小鼠后出核较少给予中和单抗，阿片受体的作用消失干扰Ⅳ与阿片受体的激活在肝损伤的保护作用中具有重叠效应。结论激活阿片受体可有效减轻肝脏缺血再灌注损伤，降低血清转氨酶，减轻肝脏组织病理学损伤，降低肝脏组织中炎性细胞因子水平拮抗阿片受体后，可以有效翻转阿片受体激动剂的保护作用。在整体动物水平，通过相关标志物的检测证实细胞的活化参与了肝脏缺血再灌注损伤。阻断细胞后，肝损伤明显减轻，但阿片受体的肝保护作用也随即消失。在离体细胞水平，通过观察相关信号通路中几个相关靶蛋白表达情况，进步证实阿片受体的激活下调了炎症通路并抑制了的入核活化。通过野生型小鼠在体及离体的原代腹腔巨噬细胞进步证实阿片受体通过Ⅳ减少的释放，从而抑制炎症反应的瀑布级联效应。阿片受体与信号通路交互调节在肝脏缺血再灌注损伤中的分子机制紫外分光光度计型荧光定量仪型仪，离心机二主要试剂试剂生产商阿片受体与信号通路交互调节在肝脏缺血再灌注损伤中的分子机制三常用试剂主要溶液的配制苏木素染液苏木素放入无水酒精中，搅拌至其完全溶解钾明矾硫酸铝钾放入双蒸水中，加热溶解煮沸将溶解的苏木素酒精倒入明矾水溶液，混合后尽快大火煮沸，停火后待停止沸腾后慢慢加入氧化汞粉末混匀注意勿沸出，再加热煮沸分钟，速将三角烧瓶放入冷水中，冷却后过夜，第二天过滤。放周后使用前加入冰醋酸染液。伊红染液伊红溶于双蒸水中，加冰醋酸，加双显色试剂盒蛋白定量试剂盒氯化钠盐酸冰乙酸甲醇无水乙醇和异丙醇上海试剂厂琼脂糖溴酚蓝叠氮钠瑞芬太尼宜昌人福药业水合氯醛上海化学试剂公司检测试剂盒深圳达科为生物公司苏州大学硕士学位论文蒸水，加冰醋酸，加双蒸水，滤纸过滤，沉淀放于烤箱中烤干，然后乙醇。，双蒸水定容至，调值。的枸橼酸缓冲液枸橼酸三钠，柠檬酸蒸水定容至，调值。四实验动物雄性小鼠周龄，体重克，由中国科学院实验动物中心上海提供。小时昼夜交替，自由饮水和进食，室温维持在，定期消毒笼具。所有动物实验根据相关管理条例及使用指南实施。实验方法制作小鼠肝脏缺血再灌注损伤动物模型参照等的方法制作小鼠肝脏缺血再灌注损伤动物模型。具体方法如下术前禁食，自由进水，根据小鼠体重腹腔注射水合氯醛进行麻醉，麻醉后小鼠仰卧位固定，酒精消毒皮肤，沿腹部正中线切口进腹，从周围组织中分离出肝门部血管，用微血管夹夹闭肝动脉和门静脉左中分支，完全阻断左中肝叶血供，造成肝脏缺血，阻断成功，关闭腹腔，缺血肝脏组织颜色由红色转为白色，提示建模成功。然后，缺血后再重新打开腹腔，移走微血管夹以解除缺血，恢复肝脏血供，肝脏颜色在短时间内由苍白变为鲜红提示再灌注模型成功。用手术线缝合关腹。在再灌注后从眼眶静脉取血，颈椎脱臼处死后收集肝组织标本。假手术组小鼠除了不使用无损伤微血管夹外其余操作同模型组。二分组及处理见图阿片受体与信号通路交互调节在肝脏缺血再灌注损伤中的分子机制假手术组组，小鼠腹腔注射生理盐水，只开关腹腔，不使用微动脉血管夹，不行肝脏操作缺血再灌注对照组组，小鼠腹腔单次注射生理盐水，停药，再打开腹腔，使用微动脉血管夹，行肝脏操作阿片受体激动剂预处理组组根据相关浓度梯度，再分为三个亚浓度组分别经小鼠腹腔单次注射阿片受体激动剂瑞芬太尼预处理，停药，再行肝脏操作阿片受体激动剂对照组组，小鼠腹腔单次注射阿片受体激动剂瑞芬太尼预处理，停药，只打开腹腔，不用微动脉血管夹，不行肝脏操作图第部分实验分组及处理示意图苏州大学硕士学位论文分组及处理见图假手术组组，小鼠腹腔注射生理盐水，只开关腹腔，不使用微动脉血管夹，不行肝脏操作缺血再灌注对照组组，小鼠腹腔单次注射生理盐水，停药，再打开腹腔，使用微动脉血管夹，行肝脏操作阿片受体激动剂预处理组组根据图相关实验，选取激动剂最佳有效浓度，经小鼠腹腔单次注射阿片受体激动剂瑞芬太尼预处理，停药，再行肝脏操作阿片受体拮抗剂处理加激动剂预处理组组，操作前天，每天腹腔注射纳洛酮，根据图相关实验，选取激动剂最佳有效浓度，经小鼠腹腔单次注射阿片受体激动剂瑞芬太尼预处理，停药，再行肝脏操作阿片受体拮抗剂处理组组，操作前天，每天腹腔注射纳洛酮，再行肝脏操作阿片受体拮抗剂对照组组，操作前天，每天腹腔注射纳洛酮，只打开腹腔，不使用微动脉血管夹，不行肝脏操作阿片受体与信号通路交互调节在肝脏缺血再灌注损伤中的分子机制图第部分实验二分组及处理示意图三血清谷丙转氨酶谷草转氨酶测定所有小鼠在实验结束后摘眼球放血，收于管中，室温静置，待血样凝固后转分离心分钟，分离血清，由型全自动生化分析仪测定。四肝脏组织染色观察病理学变化肝脏组织固定切取小鼠肝脏组织，置于中性甲醛固定过夜，再行组织脱水透明浸蜡及包埋。石蜡切片脱蜡至水相切片常规厚度，连续或间断切片烤箱烘烤使切片紧贴。二甲苯各分钟，酒精各分钟，双蒸水分钟。苏州大学硕士学位论文染色将切片浸入苏木精染液中染色，用双蒸水洗去剩余苏木精，酸性酒精溶液盐酸酒精分色，自来水冲洗，双蒸水洗，酒精各，伊红染液染色，酒精涮洗次，酒精各，石炭酸，二甲苯各，擦去多余二甲苯后滴加中性树脂，封片后晾干。五实时定量检测肝脏组织中表达肝脏组织总抽提取适量肝脏组织，充分碾磨后置于水处理过的管中加，充分混匀，室温加入氯仿，用力震荡，室温静置,离心小心将上层水相约转移至新的水处理过的管中加入异丙醇，用力震荡，室温静置,离心管底可见沉淀，弃上清，酒精充分洗涤沉淀,离心弃上清，室温干燥沉淀加水溶解沉淀检测浓度和纯度在间，可用于后续实验，保存。以随机引物逆转录合成随机引物水补齐至水浴冰上阿片受体与信号通路交互调节在肝脏缺血再灌注损伤中的分子机制加，反转录酶，水，总体积为水浴所得终产物即为，保存。实时荧光定量相关靶基因的引物设计如下用型实时荧光定量仪检测荧光信号，根据荧光信号强度检测体系中双链数量。反应体系如下，水扩增程序如下共个循环，检测荧光信号。根据溶解曲线可知，所设计的引物具有较高特异性根据扩增曲线软件分析结果见图，获得靶基因和内参基因的苏州大学硕士学位论文值目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数，采用法进行相对定量分析。图溶解曲线和扩增曲线示意图六酶联免疫吸附实验检测血清中含量苏州大学硕士学位论文阿片受体与信号通路交互调节在肝脏缺血再灌注损伤中的分子机制研究生姓名专业名称申请学位级别导师麻醉学专业临床医学硕士学位论文提交日期二〇三年五月学位授予日期二〇三年七月苏州大学•苏州目录主要英文缩略词表中文摘要英文摘要前言第部分阿片受体在肝脏缺血再灌注损伤中作用的在体实验研究实验材料实验方法实验结果第二部分细胞在阿片受体介导的肝缺血再灌注损伤保护效应中的作用实验细胞在阿片受体介导的肝缺血再灌注损伤保护效应中的在体研究实验材料实验方法实验结果实验二细胞在阿片受体介导的肝缺血再灌注损伤保护效应中的离体研究实验材料实验方法实验结果第三部分阿片受体与信号通路交互调节在肝脏缺血再灌注损伤中的分子机制研究实验材料实验方法实验结果全文小结综述参考文献发表论文情况致谢阿片受体与信号通路交互调节在肝脏缺血再灌注损伤中的分子机制主要英文缩略词表英文缩写英文全称中文译名谷丙氨酸氨基转移酶天冬氨酸转氨酶缺血再灌注磷酸缓冲液聚丙烯酰胺光密度二氨基联苯胺苏木素依红十二烷基硫酸钠胎牛血清千道尔顿样受体核转录因子肿瘤坏死因子白介素高迁移率蛋白乙二胺四乙酸苏州大学硕士学位论文中文摘要背景肝脏缺血再灌注，损伤是临床常见的病理生理过程，多见于肝脏外科相关手术包括肝移植肝叶切除等及休克，腹部外伤等。目前，肝脏损伤后发生的肝功能障碍仍然是临床上急需解决的个问题，如何防治这类损伤是围手术期肝保护相关领域的热点。大量研究表明炎症通路与内源性损伤相关蛋白在肝脏缺血再灌注损伤的发生发展中占据重要地位。阿片受体激动剂的器官保护作用在心脏神经系统中进行了深入的研究，但是有关阿片受体的肝保护作用仍鲜有报道。我们课题组前期研究已证明，阿片类药物预处理能通过通路有效减轻肝损伤。本研究旨在进步探讨阿片受体的激活下调炎症相关信号通路在肝脏损伤中的机制。方法采用小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型，比较假手术组缺血再灌注对照组阿片受体激动剂预处理组阿片受体激动剂对照组之间血清中转氨酶肝脏组织结构变化的差异以及水平。为观察阿片受体在阿片类药物预处理肝保护中的作用，随机分为六组，比较假手术组缺血再灌注对照组阿片受体激动剂预处理组阿片受体拮抗剂处理加激动剂预处理组阿片受体拮抗剂处理组阿片受体拮抗剂对照组。比较各组之间再灌注后血清中转氨酶肝脏组织结构变化的差异以及水平。检测细胞相关表达，免疫组织化学染色检测细胞标志物表达采用氯化钆清除小鼠肝脏细胞，观察阿片受体在阿片类药物预处理肝保护中的作用，参照上述分组，比较各组之间再灌注后血清中转氨酶肝脏组织结构变化的差异以及水平。观察小鼠巨噬细胞系在缺氧复氧处理后及其下游相关信号通路蛋白表达活化情况，以及的入核现象及胞内定位。阿片受体与信号通路交互调节在肝脏缺血再灌注损伤中的分子机制采用基因敲除老鼠与野生鼠对照，参照以上处理，观察缺血再灌注损伤后血清水平重要内源性配体缺血再灌注损伤后的胞内定位中和抗体对肝脏缺血再灌注损伤后血清水平的影响