血清，保存备用。取出试剂盒，复温分钟，按试剂盒说明书配制所需洗涤液标准品生物素工作液等。在试剂盒提供的板条上加入不同浓度的标准品，预留空白孔，并加入样品，密封板条口后于孵箱孵育分钟。洗板次，可使用滤纸垫在板下用力拍打，保证洗板的效果。每孔加入的生物素化抗体工作液，预留空白孔，密封反应孔后孵箱孵育分钟。再次洗板次，可使用滤纸垫在板下用力拍打，保证洗板的效果。每孔加入的酶结合工作液，预留空白孔，密封反应孔后孵箱孵育分钟。再次洗板次，可使用滤纸垫在板下用力拍打，保证洗板的效果。每孔加入的显色剂，避光条件下孵箱孵育分钟进行显色反应。每孔加入的终止液，充分混匀，酶标仪波长检测值，根据标准孔的数值制作标准曲线，计算小鼠血清数值。五制作小鼠巨噬细胞系细胞的内毒素攻击模型细胞培养传代，观察其生长状态良好，完全贴壁后，加入内毒素处理，普通培养箱中温度度水平恒定的值为相对饱和湿度为的培养条件常规培养，每组实验重复三次。分组及各组处理组普通培养箱培养条件为度恒温的的值的相对湿度中常规培养待细胞贴壁，不作其它任何特殊处理。组内毒素处理组细胞生长状态良好，正常贴壁后，分别加入终浓度为内毒素处理，并根据预实验结果选择内毒素为最佳浓度，普通培养箱培养条件为度恒温的的值的相对湿度培养。组阿片激动剂预处理组细胞生长状态良好，正常介导通路参与阿片激动剂肝保护作用的机制研究贴壁后，分别加入终浓度为的阿片激动剂瑞芬太尼预处理，根据预实验结果选择为最佳浓度，普通培养箱培养，加入内毒素处理。组阿片激动剂对照组细胞生长状态良好，正常贴壁后，分别加入终浓度为的阿片激动剂瑞芬太尼预处理，根据预实验结果选择为最佳浓度。六免疫印迹细胞蛋白的提取弃去六孔板中细胞培养基，可用吸水纸吸干倒扣的六孔板的培养基或者采用移液管直接吸走剩余培养基。六孔板的每个孔加约预冷的生理盐水。平放轻轻摇动洗涤细胞，并清洗残余培养基，弃去生理盐水。重复两次后洗尽培养基，六孔板置于冰上。按裂解液加的比例配制细胞蛋白裂解液，摇匀置于冰上。要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合每孔细胞加含的裂解液，冰上裂解分钟，或为使细胞充分裂解可将六孔板置于摇床上。分钟后，用干净的细胞刮棒迅速将细胞刮下，用枪将细胞移至管中，并充分吹打混匀。离心机，离心分钟。提前开离心机预冷取离心后的上清置于管中，保存。蛋白含量的测定法制作标准曲线从取出，室温融化后，备用。取干净的孔板，按个浓度梯度加入标准品，用于制作标准曲线按下表在孔板中加入标准品双蒸水将试剂按的比例混匀后，每孔加入的混合液，介导通路参与阿片激动剂肝保护作用的机制研究避光孵育分钟酶标仪处测定各孔的吸光度值，根据绘制的标准曲线计算出蛋白浓度蛋白跑胶清洗玻璃板取适量清洗剂滴于的玻璃板上擦洗，清洗后自来水冲净，晾干。配胶和上样玻璃板对齐后夹紧放在架子上，为避免漏胶造成玻璃板底部进入气泡，可采用保鲜膜事先覆盖玻璃板的底部。按前述配方配制分离胶，混匀后灌胶，灌胶时需要快速均匀来回加，避免胶凝固不均，灌胶之后加满异丙醇。待分离胶凝固之后配制的浓缩胶，弃去上层异丙醇并用滤纸吸干，加浓缩胶时需避免气泡混入玻璃板，灌胶之后插入配套的孔梳子，待胶凝后垂直拔去梳子，洗净备用。取适量蛋白样品，加入上样缓冲液稀释至，混匀后沸水中煮蛋白约分钟，使蛋白变性，每个上样孔加入蛋白样品。蛋白电泳电泳液中跑胶，电压下跑胶分钟，待条带基本跑齐，电压改为，至溴酚蓝刚泳出凝胶后结束电泳。转膜采用孔径的膜转膜，用直板将凝胶撬下，切的时候注意保持凝胶的完整性，操作时戴手套避免污染膜上蛋白。切好胶后按黑胶白膜的顺序在转膜夹上依次放好滤纸凝胶膜滤纸，玻璃棒赶走气泡，并做成三明治夹，夹子夹紧后放入转膜槽中，并需要认真校对正负极，然后放入转膜液中。冰浴，恒定电压转膜两小时后取出膜。的丽春红染液脱色摇床上染膜分钟，观察膜上蛋白，摇床上洗分钟。封闭用含脱脂奶粉的在脱色摇床上室温封闭不小于。抗原抗体反应丢弃封闭液，摇床上洗膜约分钟。按标记的条带剪好所需区域的膜。用含的按照适当比例稀释抗体。将膜放入抗体盒中，分别加入上述抗体，转膜面朝下，赶走气泡，使抗体与膜充分接触，置于冰箱过夜。抗孵育至少，取出膜，脱色摇床上洗次分钟。同法加入稀释的羊抗兔或羊抗鼠标记的二抗，室温摇床孵育后，用洗膜次分钟。化学发光反应取免疫印迹化学发光试剂，液与液等比例混合后，滴加在膜上使之充分反应分钟左右此过程需避光，塑料薄膜覆盖固定后置于摄影暗匣内。显影暗室条件下，将感光胶片重叠置于膜上，闭合摄影暗匣，曝光时介导通路参与阿片激动剂肝保护作用的机制研究间可视蛋白反应后发光强弱所定，般分钟。取出感光胶片后显影液中显影，时间约，看到明显的蛋白条带后即需终止反应，般不需太久，易造成曝光过度。定影之后冲洗晾干，扫描图片。软件灰度分析扫描后的图象保存为格式，软件进行灰度分析。七统计学处理数据采用统计软件分析，所有数据均以平均数标准差表示。组间比较采用，多组间数据的差异比较采用或，值表示有统计学显著差异。三实验结果阿片激动剂预处理减轻小鼠肝脏缺血再灌注损伤阿片激动剂预处理对缺血再灌注损伤小鼠血清水平的影响血清中谷丙转氨酶谷草转氨酶的水平高低是临床评价肝功能的最重要指标。如图所示，假手术组组和阿片激动剂对照组的的水平较低，缺血再灌注对照组的血清水平较假手术组和阿片激动剂对照组明显升高。阿片受体激动剂预处理组组缺血再灌注损伤后的水平较组均显著降低，差异具有统计学意义，表明阿片激动剂预处理减轻小鼠的肝脏缺血再灌注损伤。介导通路参与阿片激动剂肝保护作用的机制研究图不同处理组小鼠血清水平阿片激动剂预处理对缺血再灌注损伤小鼠肝脏组织病理学变化各组取肝脏组织进行石蜡包埋后切片，染色，观察肝脏组织的病理学变化。观察各实验组的肝细胞坏死及炎症细胞的浸润。如图所示，组肝细胞出现大片的坏死，呈累及整个肝小叶的大范围细胞坏死，胞核固缩，肝小叶及汇管区大量炎性细胞浸润组的部分肝区可见点状坏死或碎片状坏死，未见大片坏死，肝小叶结构较完整，炎性细胞浸润较组明显减轻而组及组肝小叶结构清晰，组织正常，未见明显肝细胞的坏死以及炎症细胞浸润。图不同处理组小鼠肝脏组织病理学变化介导通路参与阿片激动剂肝保护作用的机制研究目录摘要中英文略缩词对照表前言第部分受体在阿片激动剂的肝缺血再灌注损伤保护效应中的研究实验材料二实验方法三实验结果四讨论第二部分参与阿片肝保护作用实验参与阿片肝保护作用的在体研究实验材料二实验方法三实验结果实验二参与阿片肝保护作用的离体研究实验方法二实验结果三讨论第三部分与通路介导阿片肝保护效应的机制研究实验方法二实验结果三讨论全文小结综述参考文献在读期间发表论文和科研工作情况说明致谢介导通路参与阿片激动剂肝保护作用的机制研究摘要研究背景和目的肝缺血再灌注损伤，是临床上常见的病理生理过程，多见于肝叶切除肝移植等肝脏外科相关手术，是导致围术期严重并发症的重要因素。目前，肝脏损伤后发生的肝功能障碍仍然是临床上急需解决的个问题，如何防治这类损伤是围手术期肝保护相关领域的热点。前期研究证实阿片激动剂通过诱导的生成发挥肝保护效应，表明炎症通路与阿片激动剂的肝保护作用存在内在的联系。在激活阿片受体的信号转导及调控中起着重要的作用。作为的负调控因子，当蛋白偶联受体激活时可易位至胞膜与受体结合，促进受体内化脱敏。与细胞内蛋白结合参与调节胞内信号通路传导，在细胞生长凋亡免疫调控等过程中发挥重要作用。已有文献已证实参与调节机体的炎症和免疫反应过程，通过下游关键分子肿瘤坏死因子受体相关因子调节κ的活化，并与结合成为负调控因子，参与多种炎症性疾病的发生发展。此外，有研究证实阿片受体与的亲和力较其它亚型更强。本实验拟探讨与受体在阿片激动剂肝保护作用中的具体机制。研究方法采用小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型，比较假手术组肝脏缺血再灌注损伤组阿片受体激动剂预处理组阿片受体激动剂对照组之间血清转氨酶肝脏病理学变化的差异。为观察受体在阿片药物预处理肝保护中的作用，比较敲除小鼠和野生型小鼠的肝脏缺血再灌注组和阿片激动剂预处理组的肝脏组织的表达水平。并通过体外的刺激模型模拟体内肝脏缺血再灌注损伤，比较阿片激动剂预处理组与处理组的蛋白表达差异。采用的小鼠肝缺血再灌注模型，将小鼠随机分为组，阿片激动剂预处理组肝缺血再灌注组阿片激动剂对照组，检测各组小鼠肝组织的的表达。体外采用细胞模拟肝脏细胞，观察阿片激动剂预处理细胞后的蛋白表达。通过采用干扰细胞的表达，观察阿片激动剂对引起的细胞的活力和凋亡的影响。通过采用干扰细胞的表达，观察阿片激动剂预处理对处理后的细胞的蛋白表达以及和免疫共沉淀结合的影响。介导通路参与阿片激动剂肝保护作用的机制研究结果阿片激动剂预处理组的小鼠血清转氨酶和肝脏组织损伤均较缺血再灌注对照组明显减低，野生型小鼠组阿片激动剂预处理减轻肝缺血再灌注小鼠的肝脏炎性因子释放，敲除小鼠组的阿片激动剂的肝保护作用消失。体外实验中，阿片激动剂减轻引起的细胞中蛋白表达。阿片激动剂预处理引起缺血再灌注小鼠肝脏的表达升高，体外的细胞实验中，阿片激动剂的预处理促进细胞中的表达，并有向胞膜募集的趋势。采用干扰细胞的后，阿片激动剂预处理对导致的细胞损伤的保护作用消失。阿片激动剂预处理减低刺激后升高的蛋白表达，干扰后，该作用消失。而且阿片激动剂促进和免疫复合物的形成。结论阿片激动剂的预处理减轻小鼠的肝脏缺血再灌注损伤，并通过途径实现其肝保护效应。阿片激动剂通过发挥肝保护作用，干扰后阿片激动剂的肝保护作用消失。阿片激动剂通过影响蛋白活化水平，并通过增加与免疫复合物形成抑制引起的炎症反应。关键词肝脏缺血再灌注，阿片激动剂，样受体，介导通路参与阿片激动剂肝保护作用的机制研究,