步激活有关。关键词巨噬细胞凋亡胆固醇万方数据万方数据，引物反应体系组成上下游的引物各，高压水，用指弹混匀，然后短速离心，按以下条件进行反应预变性变性，退火，延伸，进行个循环，最后总延伸。产物鉴定程序结束后，各取产物，琼脂糖凝胶电泳用全自动凝胶分析系统进行灰度扫描分析并保存结果。五检测蛋白的表达取融合度生长状态良好的各组细胞，用冰洗次，加入裂解液和的混合液比例为置于冰上裂解，用细胞刮刮下蛋白离心，吸取上清至管中放到冰箱中备用。蛋白质的含量用蛋白定量方法进行计算。然后在提取的蛋白质中加入凝胶上样缓冲液，沸水中煮蛋白质，使其变性，保存备用。配制聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳分离积层胶，分离胶，湿转膜，配制的脱脂牛奶封闭液轻摇封闭，按抗体说明书的比例加入稀释的抗，孵育过夜，洗次，每次，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔山羊抗鼠二抗的稀释比例分别为和，孵育，然后用洗膜次，每次，用蛋白质印迹荧光检测试剂盒在光片上显影，胶片在凝胶图像分析系统中进行扫描，然后按照对照组的面积灰度值为与实验组的灰度值进行比较和半定量分析。六油红将各组细胞培养到置有盖玻片的孔细胞培养板中，待细胞长到融合状态时，换无血清培养基并加入的，培养待用。洗次，吸干水分，的中性甲醛固定，弃中性甲醛，用油红染色液染色，蒸馏水洗次后，苏木素染色，洗次，用荧光倒置万方数据显微镜观察细胞内的脂滴并拍照。七酶荧光检测细胞内胆固醇的含量取各个组别的对数生长期细胞，接种于直径的培养皿中，置于，培养箱中培养，待细胞长到融合状态时，换含有的无血清培养基，培养，然后倒掉培养基，洗遍后，直接用细胞刮刀刮取细胞，离心，弃上清，加入异丙醇吹打混匀，超声破碎次，每次裂解细胞，然后，离心，取上清，用试剂盒蛋白定量。用的三氯乙酸沉淀蛋白后，室温离心，然后用上清液做胆固醇的检测，以异丙醇作为内标作标准曲线，依照试剂盒说明进行操作测量细胞内总胆固醇含量的反应体系以体积进行计算，取磷酸盐缓冲液，穿透液，胆酸钠，羟基苯乙酸，过氧化物酶，胆固醇酯酶，含胆固醇的上清液，避光孵育测量细胞内游离胆固醇含量的反应体系以体积进行计算，磷酸盐缓冲液，不加胆固醇酯酶，其余的试剂体积同上，避光孵育把待测样品上样于比色皿中，放到荧光分光光度仪中，采用柱，柱温，流速每分钟，在的紫外光下进行检测，胆固醇按照峰面积进行定量，内标校准，以细胞蛋白为单位。八检测细胞的活力取对数生长期的各组细胞，以每孔个细胞接种于孔板，孔，每组细胞按个复孔进行接种，置于，培养箱中培养。待细胞长到融合状态时，每种细胞的个复孔加入含有的无血清培养基，另个复孔同时用无血清培养基处理，继续培养后，每孔加的，培养后弃去培养基，每孔加入，轻摇分钟混匀，用酶联免疫检测仪在波长处读取光密度值。通过与对照组相比得到实验组的抑制情况。按以下公式计算抑制率抑制率，加药组平均吸光度值对照组平均吸光度值万方数据九流式细胞术检测细胞的凋亡取各个组别的对数生长期细胞，以的密度接种于直径的培养皿中，置于，培养箱中培养，待细胞长到融合状态时，换无血清培养基并加入的，培养后收集细胞。洗次，胰蛋白酶消化，用含的培养基终止消化，吹打成细胞悬液，离心，用洗细胞沉淀次，离心，弃上清，用残余吹打成细胞悬液，吸入到含有，冰乙醇的管中，固定过夜。样品寄到北京中国中医科学院基础理论研究所进行检测。十统计学方法所有数据均使用均数标准差来表示。数据统计用进行处理，组间的比较用单因素方差分析检验，然后用最小有意义差异检验，来进行均数间的多重比较，以来判定差异有无显著性的意义。万方数据实验结果序列鉴定由于实验需要，我们对人源性重组质粒进行序列鉴定。将重组质粒接种划板，随机挑取个单克隆经初步鉴定后进行测序，进步确定插入片段是否正确。结果显示插入片段的阅读框正确没有读码框移位没有移码突变。测序结果经与上序列进行同源性比较，同源性为，与来源片段致。图只显示部分测序结果图测序结果稳定转染细胞稳定转染周后形成的单克隆细胞将测序成功的空质粒分别稳定转染细胞，经的筛选两周后所形成的单克隆细胞拟为稳定转染细胞株并扩大培养进行后续实验。图筛选两周后的单克隆细胞单克隆细胞株单克隆细胞株正常细胞万方数据鉴定取生长状态良好融合度为的各组细胞，提取总做鉴定，结果显示人源性转染组细胞存在人基因表达。说明稳定转染巨噬细胞株建立成功。图鉴定表达水平鉴定为了进步验证稳定转染细胞株是否建立成功，我们提取了细胞总蛋白做鉴定，结果显示转染组细胞蛋白表达水平约是正常组和空转载体组的倍，具有显著的统计学意义。进步说明稳定转染细胞株建立成功。正常细胞组转染组转染组万方数据图转染细胞蛋白表达水平组促进孵育的巨噬细胞内的荷脂为观察对处理的细胞内脂滴的影响，对正常细胞以及转染空载体和的细胞处理，油红染色，结果发现，与未转染组细胞空质粒转染组细胞相比，转染细胞内脂滴明显增多。转染组万方数据图转染对处理的细胞内脂滴的影响油红染色正常细胞，正常细胞处理，转空细胞处理，转细胞处理增加孵育的巨噬细胞内的胆固醇含量为了进步确定对处理的细胞胞内胆固醇含量的作用，用对各组细胞处理，用酶荧光法检测细胞内胆固醇的含量。结果发现孵育后细胞内游离胆固醇由升高至，说明细胞荷脂模型建立成功转染空载体组细胞内游离胆固醇与模型组细胞内游离胆固醇相比，无统计学差异与模型组细胞内游离胆固醇和转染空载体组细胞内游离胆固醇相比，转染组细胞内游离胆固醇升高至万方数据分类号密级编号硕士学位论文过表达对诱导巨噬细胞凋亡的影响研究生姓名崔淑华指导教师姓名职称庹勤慧副教授学科专业名称药理学研究方向心血管药理年月万方数据南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名年月日南华大学学位论文版权使用授权书本学位论文是本人在南华大学攻读博硕士学位期间在导师指导下完成的学位论文。本论文的研究成果归南华大学所有，本论文的研究内容不得以其它单位的名义发表。本人同意南华大学有关保留使用学位论文的规定，即学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印缩印或其它手段保留学位论文学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。同意学校将论文加入中国优秀博硕士学位论文全文数据库，并按中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程规定享受相关权益。同意授权中国科学信息技术研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。对于涉密的学位论文，解密后适用该授权。作者签名导师签名年月日年月日万方数据目录缩略词表二中文摘要三英文摘要四正文引言实验材料实验方法实验结果讨论结论五参考文献六综述七发表论文八致谢万方数据缩略词表缩写词全称中文名称动脉粥样硬化凋亡信号调节激酶互补脱氧核糖核酸胆固醇环糊精死亡结构域相关蛋白细胞培养基二甲基亚砜溴化乙啶乙二胺四乙酸游离胆固醇氨基末端激酶磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应聚丙烯酰胺凝胶电泳总胆固醇蛋白质免疫印迹万方数据过表达对胆固醇环糊精诱导巨噬细胞凋亡的影响硕士研究生崔淑华导师庹勤慧副教授摘要目的观察对诱导细胞荷脂与凋亡的影响，为延缓动脉粥样硬化的病理改变提供理论依据。方法人源性基因重组质粒稳定转染细胞，应用和检测稳定转染细胞内的表达。然后用与细胞共同孵育，建立细胞荷脂模型，油红染色和酶荧光法检测细胞内荷脂蓄积情况。检测细胞活性，流式细胞术观察细胞凋亡。测定的表达情况。结果转染细胞经筛选天后，和检测转染细胞内明显高表达，表明稳定转染成功。与细胞共同孵育后，结果发现高表达组细胞胆固醇蓄积明显，并且细胞活性下调，凋亡细胞数目增加同时转染细胞组蛋白表达明显增高。结论可介导诱导的巨噬细胞凋亡，其凋亡通路可能与上调表达，继之增加下游活性，进步激活有关。关键词巨噬细胞凋亡胆固醇万方数据，