胞活性下调，凋亡率增加，细胞内，的表达明显增加经处理后，用诱导的组细胞活性明显增高，同时蛋白的表达水平明显减弱。结论蛋白能够促进孵育诱导的血管平滑肌细胞凋亡，可能与上调表达，表达有关。关键词血管平滑肌细胞细胞凋亡万方数据万方数据万方数据引言动脉粥样硬化，所引起的心脑血管生长状态良好，处于生长对数期细胞提取细胞总蛋白进行实验。加抑制剂前分组正常细胞组组，诱导平滑肌细胞泡沫细胞模型组组，转染组组，转染组。组不加任何处理因素，组，组，组加入培养小时后，分别取各个组别生长状态良好，处于生长对数期细胞提取细胞总蛋白进行实验。加抑制剂后分组正常细胞组组，溶媒组组，组，诱导平滑肌细胞泡沫细胞模型组组，转染组组，转染组组，组。组不加任何处理因素组用的预孵育组，组，组，组除组先用的预孵育后，其他都样加入培养小时，然后分别取各个组别生长状态良好，处于生长对数期细胞提取细胞总蛋白进行后续实验。总蛋白提取取加处理因素过的细胞，先去除培养基再用预冷的对其进行清洗次，然后吸干净液体，余液用滤纸吸干净。再用的胰酶进行消化，用含血清的高糖培养基对细胞进行吹打成细胞悬液，终止消化。用移液枪吸取上述的细胞悬液于高压过的管中进行离心。万方数据用移液枪吸干净上清液，然后按照裂解液和的混合液比例为加入到管中，然后置于漩涡振荡器涡旋混匀成细胞悬液，混匀后置于冰上裂解。后，把管置于离心机中，进行离心。离心完毕后，小心吸取上清液于高压过的管中，进行蛋白定量。根据蛋白定量分析试剂盒，严格按照试剂盒要求对其样品的总蛋白进行定量。分装蛋白于无菌的管中，再加入上样，涡旋混匀后置于的沸水中煮，后将其置冰箱备用。免疫印迹制胶先用洗洁精清洗干净玻璃板，用自来水冲洗干净后用蒸馏水进行润洗。检漏后根据凝胶制备试剂盒说明书分别配制的分离胶和浓缩胶。置于微型垂直电泳槽中，槽内外都加入新鲜的电泳。上样及电泳按照蛋白定量，每个孔上蛋白量。与预染蛋白可视起进行电泳。恒压跑浓缩胶后，恒压电泳至溴酚蓝完全跑到分离胶底部，关闭电源。转膜先把的膜泡到甲醇溶液中后，用去离子水漂洗后，再将其置于转移中进行浸泡。去除上层浓缩胶，按照蛋白切下所需的目的蛋白凝胶，然后再将其置于膜上，制作“金字塔”。在转膜仪上的叠放次序依次为海绵层滤纸膜凝胶层滤纸海绵面积除海绵外，个依次比个小。恒流湿转后，关闭电源。封闭取下膜于中进行漂洗，再置于的封闭液中进行封闭，常温下置于脱色摇床封闭。孵育抗用的按的比例稀释，抗，于冰箱孵育过夜大于。洗脱抗取出膜，于中进行漂洗次，每次。孵育二抗用的按的比例稀释兔抗，于室温下孵育或冰箱孵育。洗脱二抗取出膜，于中进行漂洗次，每次。万方数据显影把均匀地滴洒在膜上，用全自动化学发光图像分析系统显影拍照。⑩统计学分析以对照组的面积灰度值为与实验组的灰度值进行比较和半定量分析。五油红染色检测血管平滑肌细胞脂滴情况取生长状态良好，处于生长对数期的平滑肌细胞接种到放有消毒盖玻片的孔细胞培养板中，然后将其置于，的细胞培养箱中进行培养。待孔中细胞长到的融合时候，弃掉孔中培养基，除正常组加无血清培养基外其他组均加入含有的无血清培养基，再将其置于，的细胞培养箱中进行培养。后，弃掉培养基，每个皿用清洗次，吸干净皿中，用的甲醛固定细胞，后吸干净甲醛溶液，再用油红染色液进行染色，再用清洗次后，用苏木素染色，用洗去多余染料后用荧光倒置显微镜进行观察并拍照。六检测血管平滑肌细胞的活力取生长状态良好，处于生长对数期的平滑肌细胞进行细胞计数，然后接种于孔板中每孔个细胞，然后每孔再加入含有血清的高糖培养基。将孔板置于，的细胞培养箱中进行培养。待孔中细胞长到融合时候，弃掉孔中培养基，除正常组加无血清培养基外其他组均加入含有的无血清培养基，每个组个复孔，再将孔板置于，的细胞培养箱中进行培养。后，弃掉培养基，每孔加含有试剂的无血清培养基进行孵育。后，用酶联免疫检测仪在处读取光密度值，实验重复次。七流式细胞仪单染色法检测血管平滑肌细胞的凋亡率取生长状态良好，处于生长对数期的平滑肌细胞，以的细胞密度接种于的细胞培养皿中，然后将培养皿置于，的细胞万方数据培养箱中进行培养。待培养皿中细胞长到融合时候，弃掉旧培养基，除正常组加无血清培养基外其他组均加入含有的无血清培养基于，的细胞培养箱中进行培养。后，倒掉旧培养基，再用预冷的清洗次，再用的胰蛋白酶进行消化，用含血清的高糖培养基进行吹打细胞，终止消化。并将细胞混悬液收集到离心管中。细胞悬液于离心机中，离心。倒掉上清，然后用的清洗细胞沉淀，对其进行吹打混匀，然后再次，离心。倒掉上清，用剩余的余液吹打细胞，使其成细胞悬液，然后吸取到已事先加好乙醇预冷的管中，冰箱固定过夜，样品寄到中南大学进行检测。八统计学分析所有数据均采用来表示。数据统计用软件进行处理分析，样本组间比较采用单因素方差分析进行检验，两组均数比较采用检验，以或来判断统计差异是否具有显著性。万方数据实验结果序列鉴定将菌液送往上海生工生物工程有限公司进行测序，确定其插入的片段是否正确。所得数据显示质粒的插入片段其阅读框没有出现读码框移位也没有出现移码突变。所有的测序结果与上的相应序列进行同源性比较，同源性为，表示与来源片段致。图测序结果只显示部分测序结果和分别瞬时转染血管平滑肌细胞对表达的影响鉴定分别将鉴定成功的质粒瞬时转染平滑肌细胞，后提取细胞总进行鉴定，结果显示图转染的平滑肌细胞中基因的表达较正常组明显增多。万方数据图血管平滑肌细胞表达鉴定分别将鉴定成功的瞬时转染平滑肌细胞，后提取平滑肌细胞的总蛋白，然后采用方法进行鉴定，发现转染的平滑肌细胞中蛋白的表达较正常组明显增多图。万方数据图血管平滑肌细胞蛋白表达水平过表达对孵育诱导的血管平滑肌细胞内脂滴的影响与正常组比较，模型组平滑肌细胞胞浆均充满了大量的红色的脂滴，说明诱导泡沫细胞模型成功再与模型组，转染组相比较，转染组细胞内脂滴明显增多。说明在平滑肌细胞内的过表达可以促进诱导的细胞内荷脂蓄积图。万方数据分类号密级编号硕士学位论文过表达对诱导血管平滑肌细胞凋亡的作用研究研究生姓名刘锦红指导教师姓名职称庹勤慧教授学科专业名称药理学研究方向动脉硬化药物蛋白质组学与新药开发年月万方数据南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名年月日南华大学学位论文版权使用授权书本学位论文是本人在南华大学攻读博硕士学位期间在导师指导下完成的学位论文。本论文的研究成果归南华大学所有，本论文的研究内容不得以其它单位的名义发表。本人同意南华大学有关保留使用学位论文的规定，即学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印缩印或其它手段保留学位论文学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。同意学校将论文加入中国优秀博硕士学位论文全文数据库，并按中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程规定享受相关权益。同意授权中国科学信息技术研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。对于涉密的学位论文，解密后适用该授权。作者签名导师签名年月日年月日万方数据目录缩略词表二中文摘要三英文摘要四正文引言实验材料实验方法实验结果讨论结论五参考文献六综述七发表文章八致谢万方数据缩略词表缩写词英文中文名称动脉粥样硬化血管平滑肌细胞死亡结构域相关蛋白胆固醇环糊精细胞计数试剂盒二甲基亚砜氨基末端激酶凋亡信号调节激酶逆转录聚合酶链式反应聚丙烯酰胺凝胶电泳牛血清白蛋白第五组分蛋白质免疫印迹肿瘤坏死因子氧化型低密度脂蛋白特异性小干扰万方数据过表达对诱导血管平滑肌细胞凋亡的作用研究硕士研究生刘锦红导师庹勤慧教授摘要目的探讨对诱导的血管平滑肌细胞凋亡的影响以及可能的机制。方法体外培养大鼠源性血管平滑肌细胞，然后分别将人源性，质粒瞬时转染进入血管平滑肌细胞中，并通过和两种方法检测平滑肌细胞内的表达然后再用孵育小时，建立泡沫细胞模型，油红染色检测细胞内脂滴情况。再分别采用法检测血管平滑肌细胞的细胞活性，流式细胞术检测血管平滑肌细胞的凋亡情况。检测，的表达情况。为了进步明确通路在诱导的平滑肌细胞凋亡中发挥的作用，我们采用特异性抑制剂对其诱导的平滑肌细胞进行干预。结果转染后细胞经和检测细胞内表达明显增加用孵育后，组细胞内胆固醇蓄积明显，细胞活性下调，凋亡率增加，细胞内，的表达明显增加经处理后，用诱导的组细胞活性明显增高，同时蛋白的表达水平明显减弱。结论蛋白能够促进孵育诱导的血管平滑肌细胞凋亡，可能与上调表达，表达有关。关键词血管平滑肌细胞细胞凋亡万方数据，