氧物质超氧化物歧化酶硫代巴比妥酸肿瘤坏死因子组织金属蛋白酶抑制血管细胞粘附因子水溶性四唑盐万方数据依达拉奉对大鼠慢性阻塞性肺病干预作用的研究研究生江兴指导老师周玉生教授摘要目的研究自由基清除剂依达拉奉对慢性阻塞性肺病大鼠肺损伤的作用，并探讨其可能的作用机制，开拓依达拉奉对的临床应用价值。方法健康雄性大鼠只随机分为组，即空白对照组空白组模型组组乙酰半胱氨酸阳性药物对照组组依达拉奉低剂量组组依达拉奉中剂量组组和依达拉奉高剂量组组。模型组参照宋平脂多糖气管内滴入加被动吸烟法熏烟复制大鼠模型组运用同样的造模方法复制大鼠模型，每次被动吸烟前予以腹腔注射依达拉奉低中高剂量组造模方法同模型组，每次熏烟前分别予以依达拉奉腹腔注射。空白对照组不做熏烟处理，气管滴注及腹腔注射均予以生理盐水。造模周后，测定大鼠肺功能，经微机处理计算出呼吸频率呼气阻力动态肺顺应性及吸气峰流速。取血，检测各组大鼠血浆丙二醛水平和超氧化物歧化酶活力。取大鼠支气管肺泡灌洗液，进行白细胞计总数白细胞分类计数，测定上清液肿瘤坏死因子白细胞介素的水平。取右上肺做病理切片，染色，测量平均内衬间隔和平均肺泡数，免疫组化方法检测各组大鼠肺组织中基质金属蛋白酶基质金属蛋白酶组织金属蛋白酶抑制因子的表达。结果组大鼠明显高于空白组，差异有统计学意义，而显著降低，与空白组有显著性差异，与中高剂量的万方数据依达拉奉可以显著改善大鼠，差异有统计学意义。模型组大鼠血浆氧化产物水平显著升高，与空白组相比，差异有统计学意义。与各剂量的的依达拉奉均能降低大鼠血浆水平，差异有统计学意义。组大鼠白细胞总数与中性粒细胞百分率明显增加，差异有统计学意义。与中高剂量的依达拉奉可以显著降低白细胞总数，差异有统计学意义，中性粒细胞百分率可被及高剂量的依达拉奉降低，差异有统计学意义。组大鼠中水平显著升高，差异有统计学意义，与各剂量的依达拉奉均可降低大鼠中水平，差异有统计学意义。组大鼠肺组织呈现肺泡融合肺泡腔扩张等明显肺气肿样病理改变，组及组病理变化相对减轻。组大鼠与空白组相比，平均内衬间隔明显增加，平均肺泡数显著减少，差异均有统计学意义。与中高剂量的依达拉奉可以减小，增加，差异有统计学意义。组大鼠支气管肺组织及表达显著增以各样本稀释倍数即得各样本白细胞总数。白细胞分类计数将离心后的沉淀细胞用少量生理盐水重悬，用微量移液枪取小滴细胞悬液滴于玻片端，然后另外找块边缘齐整平滑的玻片作为推片，将推片的端置于细胞悬液的前方，缓慢后移，接触悬液，由于液体的张力，细胞悬液会沿着推片边缘向两侧均匀展开，然后将推片与玻片保持定角度，轻轻用力，沿玻片表面匀速向前勿停顿，直至玻片另端，形成头体尾明显的舌形薄膜。待干燥后，用铅笔在玻片头部标明组别及编号，然后用瑞氏染液染色，染色完毕后，先用低倍镜观察整个涂片，了解细胞分布及染色情况，选择细胞分布均匀染色情况好的区域，转油镜按个方向蛇形前进计数防止重复计数，计数分类个白细胞，根据细胞形态学特征分类计数巨噬细胞与中性粒细胞，分别求得巨噬细胞和中性粒细胞所占的百分比。大鼠血浆含量的测定采用硫代巴比妥法法检测各组大鼠血浆中的含量，操作步骤如下将具塞离心管分别编号为标准管标准空白管测定管和测定空白管，离心管编号后按下表加入试剂万方数据空白管标准管测定管对照管标准品无水乙醇待测样品试剂摇匀晃动几下试管架试剂二试剂三冰醋酸将上述试剂混匀，离心管塞用注射器针头刺小孔，在水浴锅中水浴约反应完毕后取出，流水冷却后，放入离心机，使沉淀完全用微量移液枪吸取定量的上清液加入比色皿中勿倾倒将比色皿置于样品池内，设置测量波长为，光径为，蒸馏水调零，测量各管吸光度值计算血浆中的含量血浆含量测定管吸光度值测定空白管吸光度值标准管吸光度值标准空白管吸光度值标准品浓度样品测试前稀释倍数。大鼠血浆含量的测定采用黄嘌呤氧化酶法法检测各组大鼠血浆中的含量，操作步骤如下取孔板，分别标记对照孔对照空白孔测定孔测定空白孔，按下表所示加入试剂对照孔对照空白孔测定孔测定空白孔待测样本双蒸水酶工作液酶稀释液底物应用液将上述试剂混匀，孵育，用酶标仪在波长下测量各孔吸光万方数据度值。正式测量前，选取例正常组样本，稀释成不同浓度进行预实验，计算抑制率，然后选取抑制率在的这管的浓度，正式进行批量试验。计算个活力单位即每毫升反应液中抑止率达时所对应的量，根据下列公式计算各组大鼠血浆中的活力抑制率对照孔吸光度值对照空白孔吸光度值测定孔吸光度值测定空白孔吸光度值对照孔吸光度值对照空白孔吸光度值。活力抑制率样本测试前的稀释倍数反应体系的稀释倍数。大鼠中与含量的测定采用酶联免疫吸附法测量大鼠中与含量。将试剂盒从冰箱拿出，放置在室温环境下平衡至少，按如下方法配置各种试剂，备用。各梯度标准品溶液的配置将装有标准品的冻存管取出。用移液枪加入样本稀释液，并用枪头反复吸打以助标准品粉末充分溶解，混匀即得标准品溶液。另取个管按顺序排好，分别编号，每个管中均加入样本稀释液。然后吸取标准品溶液到第个管中，用枪头吹打混匀。再吸取到第二个管中，轻轻吹打混匀。以此类推直至，不加入标准品，配置后的各管标准品浓度如下表所示标准品浓度编号标准品浓度编号洗液工作液的配置浓洗涤液按倍用去离子水进行稀释。生物素标记抗体工作液的配置生物素标记抗体液按倍用生物素标记抗体稀释液进行稀释。辣根过氧化物酶标记亲和素工作液的配置辣根过氧化物酶标记亲和素按万方数据倍用辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液进行稀释。加样取出酶标板，分别设标准品孔待测样本孔标准品与待测样品均设副孔。每孔分别加上述配置好的标准品溶液或待测样本溶液，轻拍几下酶标板，以助溶液与酶标板充分接触，覆上板贴，放入恒温箱中温育约小时。温育完毕后，取出酶标板，去除板贴，迅速将酶标板倒扣在吸水纸上，以弃去孔内液体，换吸水纸，重复拍打几次，以甩干孔内残余液体，不要用洗液工作液洗涤。按上述步骤甩干后，每孔均加入生物素标记的抗体工作液加入顺序与加样顺序相同，加液完毕后，覆上新的板贴，放入恒温箱中温育小时。如前述办法弃掉孔内液体并甩干。然后每孔加洗液工作液，每次浸泡，洗板次，再次弃去液体并甩干。依序每孔加入的辣根过氧化物酶标记亲和素工作液，贴上新的板贴，放入恒温箱中温育小时。如前述方法弃掉孔内液体并甩干，每孔加入的洗液工作液，每次浸泡，洗板次，弃掉洗液工作液并甩干。按照加样顺序，每孔加底物溶液，盖上新的板贴，置于恒温箱中，关上箱门，避光显色。显色段时间后以上，根据肉眼观察显色情况，当标准品前孔出现梯度蓝色，后孔蓝色不明显时，即可依序每孔加终止溶液，终止反应。加入终止溶液后，立即内将酶标板放入酶标仪中，调节波长为，依序测量各孔的光密度值值运用专业绘图分析软件绘制标准曲线，求出标准曲线方程。将所测得的各待测样品值代入上述曲线方程中，求得各待测样品的浓度。大鼠肺组织染色及肺组织病理学检查染色大鼠肺组织在中性福尔马林溶液中固定后，组织脱水，石万方数据蜡包埋，常规切片，将玻片放入自动染色仪的染色架内，随后按既定程序进行染色。肺组织病理分析将染色切片置于光学显微镜下，运用病理图像分析系统，在放大倍条件下，在显示器视野正中心划十字交叉线，计算与此线相交的肺泡间隔数，同时测出此十字线总长度，求得，此值反应肺泡的平均直径。同时计数视野内总肺泡数，并计算出视野面积，求得个，此值反映肺泡密度。测量时注意避开大血管和支气管，每个组织切片随机选取个视野，求平均值。大鼠肺组织免疫组织化学检测取固定好的大鼠肺组织，组织脱水包埋，常规石蜡切片，将厚度的组织切片附于防脱载玻片上，烘烤。组织脱蜡水化将组织切片放入三缸二甲苯中分别浸泡，然后依次在的梯度酒精中水化，每缸，自来水充分冲洗，浸泡。将组织切片放入煮沸的柠檬酸盐缓冲液中，高压锅中高温高压修复，待修复液自然冷却，降至室温后，取出组织切片，浸洗次，每次。滴加去离子水室温孵育，以消除内源性过氧化物酶活性，洗次，每次。滴加封闭血清，室温孵育，孵育完毕后，甩掉组织上多余的液体，不用洗涤。滴加适当比例稀释的抗和分别用和倍的双蒸水稀释，冰箱过夜，洗次，每次。滴加生物素化二抗工作液，室温孵育，孵育完毕后，洗次，每次。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育，孵育完毕后，洗次，每次。显色使用显色试剂盒液加液滴，混匀，滴加到组织标本上，显微镜下观测显色情况，当组织标本出现棕色颗粒时，浸入万方数据中终止反应，然后用自来水充分冲洗。苏木素复染细胞核，自来水充分冲洗洗，酒精脱水，放入烘箱烤干，中性树脂封片。显微镜观察与图像分析将组织切片放在光学显微镜下，每张切片选择个视野含支气管横截面和肺泡，放大倍下图像采集，运用多功能彩色图像分析软件对及的表达进行分析，胞浆颜色越接近棕褐色表明阳性表达越强，用免疫组化评分来反应蛋白表达强度。统计学分析采用统计软件进行统计学分析，计量数据以均数方差表示，采用单向方差分析进行样本均数间的多重比较。为差异有统计学意义。万方数据分类号密级编号硕士学位论文依达拉奉对大鼠慢性阻塞性肺病干预作用的研究研究生姓名江兴指导教师姓名职称周玉生教授学科专业名称药理学研究方向临床药理学年月万方数据南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名年月日南华大学学位论文版权使用授权书本学位论文是本人在南华大学攻读博硕士学位期间在导师指导下完成的学位论文。本论文的研究成果归南华大学所有，本论文的研究内容不得以其它单位的名义发表。本人同意南华大学有关保留使用学位论文的规定，即学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印缩印或其它手段保留学位论文学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。同意学校将论文加入中国优秀博硕士学位论文全文数据库，并按中国优秀博硕士学