记附录攻读硕士学位期间发表的部分学术论著Ⅳ万方数据三峡大学硕士学位论文英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称氨苄青霉素碱基对互补盲肠结扎穿孔反应蛋白阈值循环数焦碳酸二乙酯达尔伯克氏改良伊格尔培养基二甲基亚砜脱氧核糖核酸三磷酸脱氧核糖核苷已二胺四乙酸二钠增强型绿色荧光蛋白胎牛血清甘油醛磷酸脱氢酶糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链蛋白糖皮质激素糖皮质激素受体万方数据三峡大学硕士学位论文人胚胎肾细胞液和，轻轻混匀后密封。依次于放置后，转入液氮生物容器中。活细胞计数用无血清的把细胞悬液稀释到个稀释倍数倍，在细胞悬液中加的台盼蓝溶液，轻轻混匀，后用血球计数板计数细胞。染成蓝色的细胞即死细胞。共转染细胞转染前，接种细胞，用含的调整细胞密度为，置于恒温培养箱内培养，待细胞融合至。转染前将弃原有培养液，更换为无血清。取质粒溶液，与混匀，并调整体积为，室温放置。取摇匀的，与混匀，室温放置。将和中的稀释液混合，边加边轻轻翻转混匀，室温避光孵育。将中的混合液加入细胞培养液中，轻轻混匀后继续培养。后弃培养液，以清洗次，加入含的，置于恒温培养箱培养过夜，次日换液。转染后每天观察细胞病变情况和绿色荧光蛋白表达情况，视情况传代培养。病毒初提液的获取镜下观察待大部分细胞变大变圆且的细胞成串脱壁时收集细胞至离心管中。离心，弃上清，将沉淀重悬于的中，放置万方数据三峡大学硕士学位论文，水浴至融，漩涡振荡，重复次，离心，收集上清，置于保存。病毒扩增以含的接种细胞，置于恒温培养箱内继续培养，待细胞融合达时，弃培养液，加入重组腺病毒初提液，孵育后加入完全培养液，置于恒温培养箱内继续培养。待大部分细胞变大变圆且的细胞成串脱壁时，按中方法收集第二轮病毒液，置于保存。纯化按照™操作说明书进行，方法如下取出纯化装置，将病毒粗制液用孔径的滤膜过滤，收集滤液。向病毒滤液中加入的，混匀后保温。向收集液中加入的，混匀。以注射器取灭菌，插入滤器后推注排气。将收集液吸入注射器中，以的速度推出，使之流经滤器。将套管入口转移到中，吸取，以的速度推出，使之流经滤器。用注射器吸取，再连接注射器和滤器凹口，推入的流经滤器到的离心管中，室温孵育滤器后，推入剩下的流经滤器，收集剩下的重组腺病毒。分装纯化的腺病毒，保存，待后用。滴度测定采用终点稀释法测定重组腺病毒的滴度，方法如下实验前，向孔板的每孔加入细胞悬液个。取个管，向第个管中加入完全培养液，其余个管中各加入完全培养液。取腺病毒原液加入第个管中，然后从第个管中取稀释液加入第个管中，以此类推，直至第个管。取出孔板，镜下观察确认细胞生长良好后，弃去培养液，在孔板的各行依次加入各稀释度的病毒液至，每行的第孔加入病毒稀释液，第孔加入完全培养液作对照。天后观察细胞病变现象，计算每行的细胞病变阳性率。病毒滴度的计算病毒滴度。为不同稀释度的细胞病变阳性率的总和。万方数据三峡大学硕士学位论文重组腺病毒感染细胞与鉴定细胞培养细胞的适宜培养液为含和青霉素链霉素双抗菌液的，培养条件为。细胞复苏换液传代冻存及活细胞计数方法如前述。感染预实验细胞的形态学改变实验分为腺病毒组和空白对照组，腺病毒组加入重组腺病毒，空白对照组加入等体积完全培养液。显微镜下观察细胞形态学改变。最佳感染条件实验共分组，空白对照组加入等体积的完全培养液，实验组按照培养液和腺病毒用量的不同共分组，具体情况见表，感染后观察绿色荧光蛋白表达情况，获取最佳感染条件及，并以此条件用于后续实验。表重组腺病毒感染细胞的腺病毒量及培养基情况分组腺病毒量培养基空白对照组正常培养基正常培养基含的正常培养基含的正常培养基含的正常培养基含的正常培养基含的正常培养基含的注为。感染实验的方法如下万方数据三峡大学硕士学位论文感染前天将细胞接种于孔板中继续培养，至细胞融合率为。取个管，在第个管中加入的完全培养基，其余个管中各加入的完全培养基。取腺病毒原液加入第个管中，再从第个管中取稀释液加入到第个管中，依次类推。此时，各管中的腺病毒浓度为至。将上述不同浓度的腺病毒依次加入到细胞中，每孔加入，空白对照组仅加入完全培养液，不加腺病毒。后，显微镜下观察细胞的形态学变化。若重组腺病毒对细胞没有明显毒性作用，继续培养后更换培养液若细胞毒性作用明显，立即更换培养液。天后，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。重组腺病毒感染细胞按照预实验摸索的最佳条件，待孔板中每孔细胞密度为时，以在中进行感染实验，感染后换液，观察细胞形态学改变及绿色荧光蛋白表达情况，后拍照。实验共分组，实验组和阴性对照组分别加入相应腺病毒，空白对照组加等体积完全培养液。表表重组腺病毒感染细胞的腺病毒用量分组腺病毒滴度腺病毒用量空白对照组阴性对照组组组组重组腺病毒的鉴定实验共分组，组组组阴性对照组分别为相应腺病毒感染细胞，空白对照组加入等体积完全培养液，然后提取细胞总，逆转录合成后，检测的表达量。总提取采用法提取细胞总，方法如下以胰蛋白酶消化细胞，加入轻轻吹打制悬，转移至离心管中。离心，小心弃上清，取加至沉淀中，反复吹打混万方数据三峡大学硕士学位论文匀，置冰上孵育后将其转移至管中。每管加入氯仿，上下颠倒，置冰上孵育。离心，吸取上层液体移入新的管。加入与中上层液体等体积的预冷异丙醇，轻轻翻转混匀，置冰上孵育。离心，弃上清后加入用水现配的乙醇。离心，弃去大部分上清。向中的沉淀中加入已用冰预冷的无水乙醇，充分混匀。离心，弃去上清后，置于超净工作台以微风吹干。待沉淀吹至基本透明时，加入水处理，待充分溶解。以分光光度计检测和比值，计算纯度及其浓度。提取的部分用于后续逆转录反应，部分分装后置于保存。逆转录反应按照公司的反转录系统操作说明书进行，方法如下在管中配制以下反应体系充分混匀，温浴，立即置于冰水混合物中冰浴。在冰上继续加入以下反应体系轻轻混匀，水浴。然后水浴。得到的产物即为，部分用与后续，部分分装后置于保存。万方数据分类号密级公开硕士学位论文基因沉默增强脓毒症血清诱导成肌细胞合成代谢的实验研究学位申请人向方华学科专业外科学指导教师徐亮副主任医师杨朝晖副主任医师二五年五月万方数据，万方数据三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名日期三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的切法津和经济后果。学位论文作者签名日期Ⅰ万方数据三峡大学硕士学位论文内容摘要目的构建靶向大鼠的腺病毒载体，研究基因沉默对脓毒症血清诱导成肌细胞代谢的影响。方法应用盲肠结扎穿孔法建立大鼠脓毒症模型，留取脓毒症血清。设计靶向大鼠的特异性，退火形成双链，插入Ⅰ和Ⅰ双酶切的载体，构建穿梭质粒，测序验证后与骨架质粒，共转染细胞，收集重组腺病毒，扩增纯化后测定病毒滴度。重组腺病毒感染体外培养的细胞，观察绿色荧光蛋白表达情况及形态学改变，测定重组腺病毒的感染效率，实时荧光定量聚合酶链式反应检测的表达量。脓毒症血清诱导后，实时荧光定量聚合酶链式反应检测的表达量。结果应用盲肠结扎穿孔法可成功建立脓毒症大鼠模型，大鼠的般情况体重肛温炎症指标细菌培养及开腹探查结果符合脓毒症诊断标准。成功构建重组腺病毒，测序结果显示正确插入，实时荧光定量聚合酶链式反应结果显示组的表达量最低，与空白对照组和阴性对照组相比，差异有统计学意义，其沉默效率为，重组腺病毒滴度为。在的感染效率为，约为。脓毒症血清诱导后，的表达量减少，的表达量增加，与对照组相比，差异有统计学意义。结论基因沉默增强脓毒症血清诱导成肌细胞的合成代谢。关键词脓毒症腺病毒载体Ⅱ万方数据三峡大学硕士学位论文，ⅠⅠ，Ⅲ万方数据三峡大学硕士学位论文目录英文缩略词表引言材料与方法实验材料实验方法