凝胶铺胶，之后加入缓冲溶液。再将的扩增产物和的上样缓冲液混合均匀后，立即上样。处理条件如下电压时间，取出胶片紫外灯下观察照相。大鼠心肌梗死面积及凋亡指数检测双染法测定心肌梗死面积大鼠缺血，血流再灌注后，将大鼠心脏原位重新结扎，经颈动脉注入伊文思蓝，用无损伤血管钳夹住主动脉，等待缺血区显示清晰后即可摘取心脏，冰液冲洗，即置于冰箱中冷冻，继之延垂直心脏左室长轴切成厚为的心肌切片，迅速置入提前预热的的氯化三苯基四氮唑溶液，避光恒温孵育。之后，福尔马林磷酸缓冲液固定。用计算机图像分析系统计算心肌缺血和梗死面积心肌梗死面积白色区面积白色区面积红色区面积。法检测心肌凋亡指数实验步骤取出经福尔马林磷酸缓冲液固定后的心肌组织，石蜡包埋并切片。经过不同浓度梯度的酒精脱水处理后，用二甲苯浸洗两次后制成蜡块浸蜡，之后将组织蜡块固定切片成约薄片，热水中铺平，贴至载玻片，烤箱过夜后再行以下操作切片脱蜡将切片按二甲苯Ⅰ二甲苯Ⅱ无水乙醇Ⅰ无水乙醇Ⅱ酒精酒精酒精酒精顺序依次处理，再用蒸馏水浸泡。滴加蛋白酶工作液，反应，用洗涤次，每次。制备反应混合液，酶溶液与荧光素标记溶液混合均匀制备反应混合液，处理组滴加的反应混合液阳性对照组先加入的Ⅰ，孵育后，吸水纸拭干玻片，再加的反应混合液，阴性对照组仅加的荧光素标记溶液，随后避光孵育。洗涤次，每次。吸水纸擦干玻片干后加的，避光孵育。洗涤次，每次，滴加显色液，室温显色，之后用自来水冲洗终止显色。复染苏木素复染，时间控制在左右，水洗后用的盐酸酒精进行分化处理，再用水洗返蓝。脱水透明乙醇脱水无水乙醇脱水次每次约二甲苯透明次每次通风橱中风干中性树胶封片。万方数据三峡大学硕士学位论文切片晾干，显微镜下观察采集图像。心肌凋亡指数计算方法光镜下观察正常心肌细胞核染成蓝色，而凋亡的心肌细胞核染成棕褐色，每张切片在凋亡细胞阳性区域随机取个以上的高倍视野。数不少于个心肌细胞核，计算凋亡指数，凋亡指数阳性细胞总细胞检测心肌组织线粒体依赖性的凋亡相关蛋白以及总蛋白及磷酸化总蛋白及磷酸化表达水平总蛋白提取取出各组组织样本，置入匀浆器中，加入组织裂解液充分匀浆样本冰上操作充分裂解后，吸取上清裂解液至的离心管，进而离心，吸取上清液即为总蛋白样品蛋白定量测定蛋白含量采用法，操作步骤按说明书进行。蛋白变性上样缓冲液混合均匀后的，加热处理，使蛋白变性。电泳各组样品取总蛋白进行上样电泳，胶浓度根据蛋白分子量配制。之后，根据预染显示判断目的蛋白电泳情况，当目的蛋白充分分离后停止电泳。转膜湿转法小心取出凝胶，根据切下目的条带，并用蒸馏水轻轻冲洗。随后，剪大小适宜的膜和滤纸，甲醛浸泡膜数秒，与滤纸共同浸泡于电转缓冲液中。然后严格按照黑色板纤维垫滤纸凝胶膜滤纸纤维垫白色板的顺序依次放好，夹紧电泳板放入转膜仪内，需注意应将黑色板侧对照黑色负极面。转膜条件，之后。封闭脱脂奶粉封闭液浸泡膜，再在室温下摇床封闭抗用封闭液稀释处理相应抗，并使膜浸泡于抗孵育液，然后孵育过夜二抗充分洗涤膜次，次。封闭液稀释相应标记的二抗稀释比，用二抗孵育液浸泡膜，在室温下摇床孵育。显色曝光充分洗涤膜次，次。将合适量的底物液滴加在每张膜上，再孵育数分钟左右。待荧光条带明显后，用滤纸吸去多余的底物液。之后，覆上保鲜膜光胶片压片，按显影液显影定影液定影顺序依次处理。统计学处理软件对所以实验数据进行统计学分析。数据均采用均数标准误表示。单因素方差分析进行组间比较。时差异有统计学意义。万方数据三峡大学硕士学位论文结果第部分成功构建大鼠心肌损伤模型压线管法结扎冠状动脉左前降支，结扎即刻就可观察到心尖部缺血变白，心电图即出现宽大波，段抬高显著，表明成功构建缺血模型。心电图Ⅱ导联评估模型构建与结扎前心电图相比，结扎即刻波增高增宽，段抬高明显，再灌注后，可见肢体Ⅱ导联段急剧压低，提示恢复血流灌注模型成功建立如图所示。第二部分重组腺病毒转染基因在心肌细胞成功表达免疫荧光检测重组腺病毒转染心肌组织后，转染基因与的表达如图所示倍转染心肌组织后，表达明显增加组中只检测到较低水平的内源性表达重组腺病毒转染心肌组织后可显著提高表达。以上结果表明重组腺病毒成功转染心肌组织，且转染的基因在心肌细胞成功表达。图大鼠各时间段心电图表现Ⅱ导联注分别代表大鼠结扎前结扎即刻及恢复血流灌注后肢体Ⅱ导联心电图表现万方数据三峡大学硕士学位论文图大鼠心肌注射后转染基因与成功表达注左侧为转染心肌组织后的免疫荧光表达图倍右侧为转染心肌组织后的免疫荧光表达图倍，其中，为荧光表达图绿色，为荧光表达图红色，为荧光表达合并图紫红色，为心肌细胞核染色后的荧光图蓝色，为与心肌细胞核荧光表达合并图。进步检测转染心肌组织后，转染基因的表达水平如图所示组与组未检测到表达与组基因表达水平均显著增加，且两组间基因表达无统计学差异。结果进步表明万方数据三峡大学硕士学位论文重组腺病毒成功转染心肌组织，且转染的基因在心肌细胞成功表达。第三部分重组腺病毒转染心肌组织后蛋白及表达水平如图所示与组相比，组组蛋白及水平均显著降低。图各组的表达水平注代表差异无统计学意义万方数据分类号密级公开硕士学位论文抑制信号通路对大鼠心肌缺血再灌注凋亡损伤的保护作用及其机制研究学位申请人郭鑫学科专业内科学指导教师杨俊教授二五年五月万方数据三峡大学硕士学位论文，万方数据三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名日期三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的切法津和经济后果。学位论文作者签名日期万方数据三峡大学硕士学位论文内容摘要目的探讨心肌过表达对信号通路介导的心肌缺血再灌注凋亡损伤的保护作用，并探讨其分子机制。方法将只级雄性大鼠随机分为组生理盐水假手术组组生理盐水缺血再灌注组组缺血再灌注组组缺血再灌注组组。采用多点注射法，将重组腺病毒载体或生理盐水在体转染大鼠心肌，转染后天构建心肌缺血再灌注损伤模型。缺血再灌注后空气栓塞法处死大鼠，采用免疫荧光及法检测转染基因表达双染法检测大鼠心肌梗死面积法检测大鼠心肌凋亡指数检测线粒体相关的凋亡级联反应表达情况以及蛋白表达。结果重组腺病毒载体转染心肌组织天后，转染基因与在心肌成功过表达。与组相比，组组组心梗面积心肌凋亡指数均显著增加。组组组三组间及蛋白表达无统计学差异。此外，相对表达率比值结果表明与组比较，组组组比值明显升高。结论及重组腺病毒成功转染心肌组织，可显著提高转染基因与蛋白表达心肌过表达可显著降低缺血再灌注心肌损伤，降低再灌注心肌细胞凋亡心肌缺血再灌注中信号通路激活，促进下游信号分子及转录因子磷酸化活化，从而参与万方数据三峡大学硕士学位论文缺血再灌注心肌细胞的凋亡损伤过程心肌过表达可抑制线粒体依赖性的凋亡级联反应，降低缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡可能通过抑制信号通路活化，从而抑制大鼠心肌缺血再灌注损伤。关键词缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡万方数据三峡大学硕士学位论文，