子受体表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂流式细胞术头颈部鳞状细胞癌丝裂原活化蛋白激酶甲基噻唑基四唑蓝鼻咽癌光密度值磷酸盐缓冲液聚偏二氟乙烯膜十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠，室温静置。用移液枪的枪头吹落贴壁培养细胞，取的细胞悬浮液转移至中。万方数据三峡大学硕士学位论文加入的，激烈振荡，然后室温静置。加入的，振荡混合。加入的预冷的，充分混匀后，离心，。弃去上层有机相，再加入的预冷的，充分混匀后，离心，。弃去上层有机相，然后将水相溶液无色下层转移至置于上的中，离心，。弃，在滤液中加入的，混合均匀。将试剂盒中的安置于上。将上述操作混合溶液转移至中，离心弃滤液。将的加入至中，离心弃滤液。将的加入至中，离心弃滤液。重复操作步骤。将安置于新的的离心管上，在膜的中央处加入的灭菌蒸馏水或，室温静置。离心，洗脱。检测基因外显子基因突变试剂盒粗提基因根据公开发表的人基因序列编号，采用美国软件并参考文献报道，由上海生工生物工程有限公司设计合成外显子特异性引物，引物具体序列见表表基因外显子引物外显子引物序列扩增号外显子上游引物下游引物扩增号外显子上游引物下游引物扩增号外显子上游引物下游引物扩增号外显子上游引物下游引物扩增反应体系反应总体积为，具体按表的次序依次加入无菌管内混合。万方数据三峡大学硕士学位论文表反应体系成分终浓度体积ⅠⅡ反应过程上述溶液混匀，短暂离心。将管置于仪上，旋好热盖，设定反应参数变性，变性，退火，延伸，共个循环，最后保温。短暂离心，将扩增产物置于保存。测序将扩增产物送至上海杰李生物技术有限公司，产物经纯化后使用型测序仪测序，所有样品均经正反双向测序。测序结果与基因序列核对分析。检测基因将提取稀释成。取出阳性质控品和酶，阳性质控品先解冻，再振荡混匀。二者均快速离心待用。分别向待测样品阳性质控品和超纯水中加入酶，涡旋器上混匀，然后快速离心。在管冰架上轻轻揭开联管反应条的条盖，将混好的和酶样品依次取加入管中，然后小心盖上条盖。离心连管反应条，将其放入荧光实时仪。设置参数。第阶段个循环。第二阶段，个循环。第三阶段，个循环。万方数据三峡大学硕士学位论文信号收集第三阶段收集和信号。保存文件，执行实时，约完成检测。统计学处理采用统计软件处理数据，计量资料用均数标准差表示，独立样本检验为有统计学意义。结果检测不同浓度凯美纳对鼻咽癌细胞株增殖的影响凯美纳最适浓度的选择常规培养鼻咽癌细胞株，状态良好时将细胞传至孔中，待细胞贴壁后，加入凯美纳药物，继续培养，设盐酸埃克替尼药物浓度组分别为及，以不加入凯美纳，代之以无酚红培养基的为阴性对照组，以单独无酚红培养基孔为空白组，以上各组均设个复孔。用酶标仪测定每孔细胞的值，用软件计算药物作用于细胞后的生长抑制率，结果显示凯美纳有抑制鼻咽癌细胞生长的作用，且这种作用呈现出定的剂量依赖性。通过法检测发现，凯美纳可抑制鼻咽癌细胞株的生长，当凯美纳作用细胞时，鼻咽癌细胞株的抑制率较时有明显差异，高达，且细胞株的抑制率明显高于其他细胞株若继续加大药物浓度抑制率无明显差异，故有统计学意义与空白对照组相比，表明高浓度的凯美纳对鼻咽癌细胞具有杀伤作用。故选择的凯美纳的最适浓度为，并认为细胞株对凯美纳具有较高的敏感性。凯美纳抑制率与空白对照组相比图法检测凯美纳对鼻咽癌细胞株生长的影响万方数据三峡大学硕士学位论文凯美纳最适时间的选择常规培养鼻咽上皮细胞及鼻咽癌细胞株，状态良好时将细胞传至孔中，待细胞贴壁后，加入凯美纳药物，分别培养及，以不加入凯美纳，代之以无酚红培养基的为阴性对照组，以单独无酚红培养基孔为空白组，以上各组均设个复孔。用酶标仪测定每孔细胞的值，采用软件计算药物作用于细胞后的生长抑制率。通过法检测发现，凯美纳可抑制鼻咽癌细胞株的生长，当凯美纳作用于细胞时，鼻咽癌细胞株的抑制率较时明显增高，鼻咽癌细胞株的抑制率高达，明显高于其他鼻咽癌细胞株，具有统计学意义与空白对照组相比。故选择凯美纳的作用时间为。凯美纳作用时间抑制率与空白对照组相比图法检测凯美纳对鼻咽癌细胞株生长的影响检测凯美纳对鼻咽上皮细胞和鼻咽癌细胞株凋亡率的影响常规培养鼻咽上皮细胞及鼻咽癌细胞株，状态良好时将细胞传至六孔板中继续培养，待细胞贴壁后，换成无血清培养基，加入凯美纳作用后收集细胞，采用双标染色后，流式细胞仪检测各细胞株的凋亡率，对照组不加药物作用，仅加入等量的。右上象限代表的是晚期凋亡继发性坏死的细胞，而右下象限代表的是早期凋亡细胞，凋亡率为右上象限和右下象限的细胞百分比之和。经统计学分析，药物处理组对细胞株的凋亡明显高于其他细胞株组，且具有统计学意义细胞株组与其他组对比，检验。结果显示凯美纳作用后各组细胞凋亡率如下组，组，组，组万方数据三峡大学硕士学位论文组组与组分别与组相比，细胞凋亡率明显增加，且差异具有统计学意义，说明凯美纳对鼻咽癌各细胞株都有抑制作用。图检测凯美纳作用对鼻咽癌各细胞株细胞凋亡率的影响法分析蛋白的变化常规培养鼻咽上皮细胞及鼻咽癌细胞株，状态良好时将细胞传至培养瓶中，待细胞贴壁后，换无血清培养基，加入凯美纳处理后收集细胞，提取蛋白质样品，方法检测蛋白水平是否存在高表达。结果显示以为内参，表明定量精确，细胞高表达蛋白。万方数据分类号密级公开硕士学位论文国产新药凯美纳对三种鼻咽癌细胞株增殖抑制的实验研究学位申请人魏飞学科专业肿瘤学指导教师许新华教授二五年三月万方数据，万方数据三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名日期三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的切法津和经济后果。学位论文作者签名日期万方数据三峡大学硕士学位论文内容摘要目的通过观察国产新药凯美纳处理鼻咽上皮细胞株及鼻咽癌细胞株后观察细胞的凋亡情况及细胞的表达情况，了解凯美纳对鼻咽癌细胞株增殖的影响，并进步探讨药物作用的可能机制。方法法检测凯美纳处理细胞后的细胞增殖及凋亡情况，选择最适作用浓度和作用时间。检测凯美纳作用于鼻咽癌细胞株后的细胞凋亡和细胞周期分布情况。检测凯美纳处理鼻咽癌细胞后的表达情况。检测凯美纳处理细胞后的基因突变情况。结果凯美纳对鼻咽癌细胞株的增殖具有抑制作用，其最适作用浓度为。凯美纳对细胞株增殖的抑制作用在较明显。凯美纳处理各细胞株后，细胞株的凋亡比例明显高于其他细胞株，具有统计学差异。凯美纳可使阻滞于细胞期。凯美纳处理各细胞株后，细胞株表达明显高于其他细胞株。检测发现基因阳性突变位于与。结论凯美纳对鼻咽癌各细胞株均具有抑制作用，以对细胞株的增殖抑制作用最强凯美纳处理各细胞株后，细胞的凋亡明显增加，细胞阻滞于期而研究发现在细胞株中呈高水平表达，且检测到鼻咽癌细胞株中基因阳性突变主要位于与。本研究结果显示凯美纳对鼻咽癌细胞株具有明显的抑制作用，其作用机制可能是通过发挥效应的，因此，可能为鼻咽癌防治的重要潜在靶点。关键词鼻咽癌凯美纳表皮生长因子受体万方数据三峡大学硕士学位论文