识别有关，那么，这些氨基酸的变化很可能影响识别密码子的功能，产生功能特异的，从而导致这些生物中终止密码子的重新分配。最近研究发现真核生物的端结构域中，高度保守的模体和“”对终止密码子的识别特异性具有明显的影响，但这些结论不断受到挑战。使用不同的实验体系和不同生物的，这些模体结构对识别终止密码子特异性的决定作用存在明显差异。另外，的翻译后修饰对其识别密码子的性质具有重要的影响，那么，纤毛虫识别密码子的特异性是否受到其翻译后修饰的影响呢本实验通过构建纤毛虫与酵母不同模体结构组成的嵌合体，分析了不同模体在密码子碱基识别过程中的具体功能用止密码子特异性的研究主要是基于人的结构，目前仅停留在功能分析的层面。现在业界对终止密码子的识别机制主要有下面几种观点。假说等认为该假说将端进行突变后，发现在端表面的螺旋或片层结构的附近有三个明显的袋状结构图。第个口袋周围由疏水氨基酸组成和，还有在螺旋上的和片层上的，且能够结合第位碱基。第二个口袋类似于个半圆的海湾，由，和的残基组成，主要结合嘌呤碱基。第三个口袋主要是由疏水性质的氨基酸组成还有个氢键结合位点在的羰基氧上，主要识别嘌呤碱基。构象发生变化后，三个口袋通过氢键与终止密码子的三个碱基结合，进而识别，和。纤毛虫识别终止密码子特异性的研究年等人提出了与致的观点，复合体的晶体研究中发现在上结合口袋的位点部分重叠。假说等人将端的二个氨基酸和突变后，发现对的影响较大，可能和决定第三位碱基的识别图。在这个假说中，主要是与之间形成氢键，使整体构象发生变化，其中起着最主要的作用。假说等人提出该假说，端中的上的四个氨基酸，和，可以识别密码子第二个位和第三位碱基图。该假说表明终止密码子的识别性质由端中的的松紧来调节。但是却认为这四个氨基酸位点对终止密码子的识别性质有定程度的影响，却不是终止密码子识别的关键位点。端与前体终止复合体连接假说等人认为终止密码子的选择性识别是通过环构象的变化来调节。氨基酸残基，和是在的对面，其中的和影响与核糖体的结合。翻译终止过程中，当进入核糖体的位点时，端和端的铰链区使模体进入到位点的尾部，这时端就会远离，则接近的编码区域，进而与终止密码子相互作用图。假说等人认为终止密码子的第位和第二位核苷酸首先被识别，紧接着在核糖体上通过构象发生变化进而识别第三位或第二位和第三位核苷酸。该假说认为识别终止密码子的步骤有步图，第步中与的侧链直接相互作用，而是结合到的区域，与此同时核糖体识别第二位核苷酸这个过程是依赖于第个核苷酸与的结合。第二步中密码子的是与的氨基作用，而是通过核糖体结合和密码子的和结合到的区域，和通过核糖体结合核糖体结合第三位核苷酸的位置在的或位核苷酸上。第章文献综述图真核生物终止密码子的识别模型图假说假说假说端与连接假说图模型米色是核糖体，绿色是，密码子的三个核苷酸分别用蓝色红色和黄色来表示。肽链释放因子与其它蛋白因子的相互作用在蛋白质翻译终止的过程中，和结合到提前终止复合物形成个三元复合物，水解使的构象发生变化，纤毛虫识别终止密码子特异性的研究进而识别终止密码子。在这个过程中，在核糖体的位点的端的可以与上的相互作用，参与终止密码子的识别。识别终止密码子过程中还有其它多种因子的参与，如螺旋酶核输出介导因子等图。此外，还可以通过端与的催化亚基形成复合物。不仅可以和相互作用，还可以通过端直接与的端相连，在蛋白质翻译的信号通路中起到很重要的作用。此外复合体还可以与相互作用影响蛋白质翻译终止的效率。所以在研究终止密码子识别的机制时，需要考虑其它蛋白因子的影响作用。赭纤虫和八肋游仆虫的特点及本课题的研究意义赭纤虫日本赭纤虫属于纤毛门，旋毛目。该纤毛虫最显著的特点是具有异型的细胞核，即至多个营养核大核，和至数个生殖核小核，。大核是合成的场所，履行正常的细胞生理活动和代谢功能，小核则为遗传重组的场所。它的遗传密码子发生重排现象，日本赭纤虫将作为终止密码子，编码为色氨酸，目前尚不清楚。八肋游仆虫八肋游仆虫是种淡水生物，属于纤毛门，游仆科。它的表膜泡的内部有类蛋白质板，可以用来提高表皮膜的坚固性。同样有大核和小核，大核为营养核，是合成的场所，履行正常的代谢功能和细胞生理活动，小核为生殖核是遗传重组的场所。该纤毛虫的有性生殖通过接合生殖完成，即两个同结合型的细胞在特定部位发生部分的融合。它的遗传密码子也发生重排现象，将和作为终止密码子，翻译为半胱氨酸。本课题研究的意义识别终止密码子的机制是蛋白质合成终止过程研究的核心和焦点。那么，中到底哪些模体或氨基酸残基参与终止密码子三个碱基的识别呢目前为止的研究结果显示，不同于原核生物的和，高等真核生物的识别终止密码子的机制更为复杂。不同的研究方法和体系不同进化地位的生物的，所鉴定的对三个终止密码子识别的结构域和氨基酸残基不尽相同，甚至有显著差别，。因此，如何全面评估识别终止密码子的机制就成为蛋白质合成终止机制研第章文献综述究的核心问题。诸多研究表明的端结构域中保守的和“”模体负责对终止密码子的识别，然而，这结果不断受到挑战。有数据显示保守的“”模体对密码子的识别也具有决定性的作用，。之前利用四膜虫和游仆虫的开展了些研究工作，得到了些实验数据，鉴定了些与终止密码子碱基识别有关的模体和氨基酸残基，定程度上支持了识别终止密码子的“非线性模型”和“孔穴模型”但仍然没有完全阐释纤毛虫识别终止密码子的特异性，也没有完全确定识别终止密码子碱基的模体和氨基酸残基。本实验主要利用低等真核生物日本赭纤虫和八肋游仆虫为实验材料，通过搭桥的方法构建了赭纤虫和游仆虫的端嵌合体，研究端二级结构之间形成的模体结构域是否对识别终止密码子的特异性起决定作用此外，蛋白质的修饰对其功能具有明显的影响。先前研究表明在翻译的起始和延伸过程中的许多因子是由磷酸化的调节起作用的。用同位素标记法，在体内发现蛋白激酶可以使端的位和位的丝氨酸发生磷酸化，但对翻译的终止效率影响不大。研究还发现中与终止密码子识别相关的保守结构域中，赖氨酸的羟基化作用显著影响对终止密码子的识别效率。因此识别终止密码的特异性与其翻译后修饰有定的联系。而我们通过预测发现的端结构域中存在多个磷酸化位点，而且这些磷酸化位点就位于终止密码子识别相关的关键模体附近，本实验通过定点突变的方法将端的磷酸化位点进行突变，以改变激酶的识别位点，进而研究这些位点的磷酸化对识别终止密码子的特异性是否具有决定作用本实验还将含有日本赭纤虫的端结构域的蛋白在大肠杆菌细胞中进行表达和纯化，磷酸酶处理分析，进步证实该结构域被磷酸化修饰。这些实验为进步研究识别终止密码子的机制提供了新的线索。届硕士学位论文纤毛虫识别终止密码子特异性的研究作者姓名郭萍指导教师柴宝峰教授学科专业生物化学与分子生物学研究方向细胞分子生物学培养单位生物技术研究所学习年限年月至年月二〇四年六月山西大学届硕士学位论文纤毛虫识别终止密码子特异性的研究作者姓名郭萍指导教师柴宝峰教授学科专业生物化学与分子生物学研究方向细胞分子生物学培养单位生物技术研究所学习年限年月至年月二〇四年六月，承诺书承诺书本人郑重声明所呈交的学位论文，是在导师指导下独立完成的，学位论文的知识产权属于山西大学。如果今后以其他单位名义发表与在读期间学位论文相关的内容，将承担法律责任。除文中已经注明引用的文献资料外，本学位论文不包括任何其他个人或集体已经发表或撰写过的成果。作者签名年月日学位论文使用授权声明学位论文使用授权声明本人完全了解山西大学有关保留使用学位论文的规定，即学校有权保留并向国家有关机关或机构送交论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印缩印或扫描等手段保存汇编学位论文。同意山西大学可以用不同方式在不同媒体上发表传播论文的全部或部分内容。保密的学位论文在解密后遵守此协议。作者签名导师签名年月日目录中文摘要第章文献综述蛋白质的翻译终止过程肽链释放因子及其功能第类肽链释放因子的结构第类肽链释放因子识别终止密码子的机制肽链释放因子与其它蛋白因子的相互作用赭纤虫和八肋游仆虫的特点及本课题的研究意义赭纤虫八肋游仆虫本课题研究的意义第二章端二级结构模体对识别终止密码子特异性的影响引言实验材料实验菌株和质粒主要的酶和生化试剂试剂的配置实验仪器实验方法端嵌合体的构建质粒洗牌技术双荧光素酶通读效率实验实验结果端嵌合体重组质粒的构建及其端结构域嵌合体识别终止密码子的性质及其端嵌合体识别终止密码子的活性及其端嵌合体的杂合蛋白在酵母细胞中稳定表达讨论第三章磷酸化的修饰对终止密码子识别特异性的影响引言实验材料实验菌株和质粒主要的酶和生化试剂试剂的配制实验仪器实验方法赭纤虫端磷酸化位点的突变质粒洗牌技术双荧光素酶通读效率实验实验结果赭纤虫的端删除或引入激酶识别序列磷酸化位点对识别终止密码子性质的影响删除磷酸化位点对识别终止密码子效率的影响引入磷酸化位点对识别终止密码子效率的影响突变体杂合蛋白在酵母细胞中稳定表达讨论第四章赭纤虫第类肽链释放因子端结构域的磷酸化修饰引言实验材料实验菌株及质粒主要的酶及生化试剂试剂的配置实验方法重组表达质粒的转化和表达目的蛋白的纯化目的蛋白的分析结果赭纤虫的端结构域在大肠杆菌中的表达赭纤虫的端结构域蛋白的纯化赭纤虫的端结构域的磷酸化分析讨论总结与展望参考文献附录攻读硕士期间取得的研究成果致谢个人简介及联系方式承诺书学位论文使用授权声明ⅠⅠ