1、逐年上升趋势。另外欧美国家实施的食物致敏成分标签法和管理，已成为制约我国虾类产品出口的最大纯度不高，且人源化也是个重要问题。第三，以免疫细胞为材料，通过基因工程克隆抗体重链和轻链部分基因片段，再经连接构建小分子抗体。其中免疫细胞获得和特异性抗体筛选是主要难点。因此针对单表位刺激建立简便而高效的体外制备高亲和力高特异性技术将有极大应用价值。完整分子制备年和创建了以杂交瘤技术为代表的单克隆抗体技术以来，已经被广泛应用于包括虾过敏在内的各种表位特异性抗体制备，具有特异性均质高重复性强成本低并可大量生产等优点。赵杰等合成了虾致敏蛋白的单表位肽用于免疫兔子，获得了特异响应的抗体，并通过实验证明和天然有同等亲和力。黄建芳等用纯化的凡纳滨对虾原肌球蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体，并获得株针对不同表位的杂交瘤。
2、珠分选法微雕法以及细胞微阵列芯片法等，但是分选所用到的特异性标记抗原通常万方数据中国计量学院硕士学位论文无市售需自己合成。另外由于可变区高变异性和重排复杂性，现行根据骨架区保守序列设计的引物扩增产物高度混杂，且数据库内尚无虾致敏片段序列，对后续筛选测序比对带来不少困难。猜想能否结合骨架区以及高变区与虾特异性表位的互补关系设计特异性引物，从而直接克隆出目的基因，可在未来做大胆尝试。三是表达方面，表位与抗体的结合区是抗体分子区肽链经多次折叠后所形成的球形顶端立体结构，因此要求在克隆出的轻链和重链区片段由组装成小分子抗体后，还必须具有有效的空间构象才能与表位结合。展示系统噬菌体核糖体酵母和表达系统大肠杆菌酵母哺乳动物细胞的优化选择将是小分子抗体由实验走向应用必须进行的工作。除上述几方面外，将小分。
3、〇四年六月万方数据，万方数据中图分类号学校代码密级公开硕士学位论文虾致敏原刺激下人淋巴细胞制备及基因研究作者潘文彬导师潘家荣研究员申请学位理学硕士培养单位中国计量学院学科专业生物化学与分子生物学研究方向食品安全关键技术二〇四年六月万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国计量学院或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名签字日期年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解中国计量学院有关保留使用学位论文的规定。特授权中国计量学院可以将学位论文的全。
4、鉴意义。本研究工作内容和技术路线研究内容本研究主要进行两方面工作是获得克隆材料，即模拟人体内免疫条件建立虾过敏原单表位刺激的体外免疫体系二是克隆获得抗体可变区基因片段，对其序列进行比对分析。万方数据中国计量学院硕士学位论文技术路线图图研究技术路线万方数据中国计量学院硕士学位论文虾致敏原体外免疫在人体内的产生依赖于抗原的刺激，以及抗原提呈细胞如树突状细胞细胞和细胞等几个免疫要素的复杂协同作用。外周血是常用细胞材料来源，但其中缺乏足够的抗原提呈细胞和特异性细胞。本章实验试图模拟人体内免疫环境建立高效的体外免疫体系，论述体外免疫细胞的获取过程。即以虾致敏原单表位多肽刺激人外周血单核细胞来源的树突状细胞，并混合单个核细胞联合培养进而激活特异性细胞增殖并大量分泌特异性。实验用到筛选过敏者血清高响应表。
5、流式测定结果图总提取步骤示意图图合成步骤示意图图反应步骤示意图图三份材料总提取物电泳结果图非过敏者产物电泳结果图过敏者产物电泳结果图过敏者免疫细胞产物电泳结果图非过敏者外周血引物κ克隆产物功能区比对鉴别图非过敏者外周血引物κ克隆产物功能区比对鉴别图非过敏者外周血引物κ克隆产物功能区比对鉴别图非过敏者外周血引物克隆产物功能区比对鉴别图非过敏者外周血引物克隆产物功能区比对鉴别图过敏者外周血引物κ克隆产物功能区比对鉴别图过敏者外周血引物κ克隆产物功能区比对鉴别图过敏者外周血引物κ克隆产物功能区比对鉴别图过敏者外周血引物克隆产物功能区比对鉴别图过敏者外周血引物克隆产物功能区比对鉴别图过敏者免疫细胞引物κ克隆产物功能区比对鉴别图过敏者免疫细胞引物κ克隆产物功能区比对鉴别图过敏者免疫细胞引物κ克隆产物。
6、抗体片段与其他功能性分子如毒素酶肽细胞因子脂质体放射性核素等连接，发挥其他效应分子在虾过敏过程中靶向生物学作用以及建立虾全部致敏蛋白表位的抗体库等也将是研究的努力方向。本研究目的和意义鉴于虾类过敏日益严峻的食品安全形势和目前虾致敏抗体研究的现状和不足，本研究试图模拟人体内环境，建立种新的便捷高效的体外免疫体系，并以此为材料来源克隆获得抗体重链和轻链可变区基因片段，分析其序列和规律。该研究成果将具有重要的理论和应用意义。是为单蛋白表位体外免疫提供了新的思路。二是为虾过敏原检测所需要的大量特异性制备提供了技术支撑。三是为虾过敏原高水平分离纯化提供了亲和吸附的特异性载体。四是为虾致敏抗体可变区基因重排与亲和力和特异性内在联系的深入研究奠定了技术基础。五是对其他致敏原及特异性抗体的研究具有良好的借。
7、胞株。然而动物源性抗体应用于人体中面临着易引起人抗鼠抗体反应的限制，因此各种抗体人源化和全人化改造研究陆续开展，先后出现了嵌合抗体重构抗体和由转基因小鼠噬菌体展示技术核糖体展示技术所制备的单克隆抗体。目前许多抗单克隆抗体都经过了人源化改造甚至临床应用，相信这些对虾过敏治疗中抗抗体的制备和应用也有重要启示。如陈家琪等以重组片段为抗原，利用杂交瘤融合技术制备出抗人单克隆抗体。且鉴定具有体外阻断与其受体结合的活性。临床药物已于年在美国上市，能万方数据中国计量学院硕士学位论文通过与血液中特异性结合，降低血清总水平，并下调肥大细胞嗜碱性粒细胞表面的高亲和力受体εⅠ的表达，从而抑制介导的超敏反应。小分子基因工程制备相较于完整的抗体分子，基因工程抗体具有分子量小组织穿透力强体内清除快免疫原性低易于表达大。
8、量生产和进行基因工程改进等优点，主要类型有单链片段单域双特异性以及由通过构成的双链或多聚抗体等。小分子抗体制备的关键是免疫细胞的获得，以及抗体重链和轻链可变区基因的获得。年等最早进行了抗体基因的扩增。但由于可变区的高度变异性使扩增相对困，至今仍是个难点。目前还未见虾小分子制备相关报道，其他领域些小分子抗体制备和临床应用已见报道。等制备了花生过敏的重链可变区片段。等构建的双特异抗体在例实验中有例诱导了原发骨髓瘤细胞由选择性细胞介导的细胞死亡。目前已有种专门治疗细胞瘤的的双特异作用于和抗原已经进人期临床研究。及等将人源化的含抗性基因单链抗体与绿脓假单胞外毒素融合，发现其优先定位在相关阳性肿瘤或癌细胞上，并能抑该细胞在裸鼠体内的生长和转移。基因工程小分子制备研究预测根据已有的小分子抗体研究进展可。
9、因工程小分子制备研究预测本研究目的和意义本研究工作内容和技术路线研究内容技术路线虾致敏原体外免疫仪器与试剂实验仪器材料试剂主要溶液配制实验方法过敏原表位合成血清免疫表位筛选单表位体外免疫结果与讨论表位多肽合成万方数据血清免疫表位筛选树突状细胞形态观察特异性分泌情况树突状细胞表型分析小结重链轻链可变区基因片段的克隆仪器与试剂实验仪器主要试剂主要溶液配制实验方法总提取合成引物设计与合成重链轻链可变区基因片段克隆连接质粒转化感受态细胞测序比对分析结果与讨论总提取可变区基因片段扩增测序分析小结结论与展望主要结论创新点展望参考文献作者简介万方数据图清单图研究技术路线图淋巴细胞分离液密度梯度离心后外周血细胞分层情况图稀释度血清表位测定结果图树突状细胞刺激分化不同阶段形态图不同阶段树突状细胞表面标志蛋白。
10、能区比对鉴别图过敏者免疫细胞引物克隆产物功能区比对鉴别图过敏者免疫细胞引物克隆产物功能区比对鉴别万方数据表清单表五个结合区氨基酸及序列表合成的五个表位多肽表血清表位筛选测定结果表细胞培养上清液特异性测定结果表引物设计表三份材料提取物紫外检测结果表三份材料同源性最高值情况万方数据缩略词表缩写英文全称中文全称原肌球蛋白重链可变区轻链可变区互补决定区骨架区单链抗体人抗鼠抗体反应外周血单个核细胞牛血清白蛋白钥孔血蓝蛋白酶联免疫吸附实验万方数据中国计量学院硕士学位论文绪论以虾为代表的水产甲壳类是联合国粮农组织确定的八大类致敏食物之。也是成年人主要食源致敏物。尤其对于亚洲地区，虾壳类是膳食结构中最主要的食物过敏来源。年我国虾类消费量已达万吨以上，居世界第位，在我国存在着数量庞大的虾过敏人群，且发病率呈。
11、多肽测定细胞培养过程中分泌情况，以及用到流式细胞仪分析鉴定树突状细胞分化过程中细胞表面相关蛋白标志的变化情况。仪器与试剂实验仪器电子天平水平离心机培养箱倒置显微镜重庆光电酶标仪流式细胞仪计水浴锅上海恒科干燥箱上海博迅材料试剂材料来源宁波市第二医院确诊虾过敏患者，女，岁非过敏健康对照者，男，岁。二者均为我校学生志愿者。实验前内采集肘内侧静脉新鲜外周血，肝素钠抗凝。主要试剂淋巴细胞分离液培养基胎牛血清胰蛋白酶万方数据中国计量学院硕士学位论文硫酸庆大霉素分装牛血清白蛋白台盼蓝分装脱脂奶粉伊利山羊抗人，康为世纪，四甲基联苯胺主要溶液配制碳酸盐缓冲液定容至磷酸盐缓冲液定容至洗涤液万方数据硕士学位论文虾致敏原刺激下人淋巴细胞制备及基因研究作者潘文彬导师潘家荣研究员学科生物化学与分子生物学中国计量学院二。
12、测将来几个热点方向是克隆材料方面，为尽量减小后续删选和比对难度，应尽可能选择分泌特异性的单种类细胞为模板来源。可选择的有虾致敏蛋白单克隆杂交瘤细胞株或经虾单表位体外免疫且高度纯化的特异性细胞，但前者制备筛选周期长且复杂及后者体外免疫条件的建立和特异性细胞的纯化是技术难点。但也有另种思路，可以先把重链和轻链可变区片段通过连接，然后经载体表达，再用相对应的特异性蛋白表位进行删选。二是克隆技术方面，基因克隆分析往往需要大量以上纯化的同质细胞，增加了实验难度，特别是对于来源有限的珍贵样本，单细胞水平的将成为解决这项困难的有力工具。尤其是应用它甚至可以找出同表位免疫细胞间由基因重排而形成的细微差异，不过该方法也面临特异性分选阻碍。目前可供选择特异性细胞筛选方法有荧光标记抗原多参数细胞分选法抗原标记磁。
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压力管理与挫折应对动态PPT 编号18078