7年间大肠埃希菌临床连续分离株耐药性变迁及质粒介导的喹诺酮类耐药基因研究_毕业论文㊣精品文档值得下载

物有较高的耐药性，且耐药性有上升趋势，耐药现象比较严重。

我院大肠埃希菌基因以基因为主，其次为基因，基因中以为主，基因亚型以为主，其次为。

未检出基因。

本研究首次以不考虑耐药背景的大肠埃希菌为研究对象，证实基因在喹诺酮类耐药和敏感菌株中均存在，喹诺酮类药物敏感菌株中基因的检出值得关注。

首次分析了基因的多态性，发现了基因的种变异型，并发现两个易变异区。

关键词大肠埃希菌耐药性连续分离菌株质粒喹诺酮类多态性温州医学院硕士学位论文，温州医学院硕士学位论文充分搅拌混匀。

方法细菌提取采用提取细菌基因组。

挑取在血平板上培养过夜的单个菌落接种到液体培养基中，振荡培养过夜温州医学院硕士学位论文取上述菌液加入到试剂盒配备的的管中，离心弃上清，加重悬细菌注意要悬浮均匀，不能残留细菌沉淀加，漩涡仪上混匀，水浴加用力震荡，离心吸弃上层小心吸取，不要破坏中层加，混合均匀，离心吸弃上层，将底层液体转到膜上，置新的的管上，离心去掉，加至滤液中，混匀将滤液转移至，离心加入于中，离心用洗两次将置的管上，离心将置新的管上，加预热后洗脱效果更好于膜中央，室温静置离心，收集洗脱液，即为细菌基因组。

细菌电泳定量制备的琼脂糖凝胶上样随机挑取部分菌株进行估计，将的稀释倍后与上样缓冲液混匀，用加样枪加入凝胶样品孔中，分别取，的的加入其余样品孔中电泳后在紫外灯下观察并估约的浓度根据估计的浓度稀释至所需浓度，冰箱保存，以备作为的模板。

引物设计首先在的中查找基因的序列信息，然后利用软件，遵循引物设计原则，根据实验需要来设计引物，引物设计好后用验证其特异性，符合要求的引物由上海生工合成比较成熟的基因引物，参照参考文献，用验证其特异性后由上海生工合成。

所用引物详见表。

温州医学院硕士学位论文表所用引物列表检测基因初筛基因用反应体系表，初筛后耐药基因阳性菌株测序体系用反应体系表，反应循环参数设置如图，每次扩增时加标本阳性对照试剂阴性对照作为质控。

表初筛体系各成分名称各成分体积终浓度正向引物反向引物聚合酶模板总计引物名称引物序列参考序列产物长度退火温度参考文献本研究本研究本研究温州医学院硕士学位论文表测序体系各成分名称各成分体积终浓度正向引物反向引物聚合酶模板总计图反应循环参数注为反应条件中的退火温度。

产物电泳检测用电子天平称取琼脂糖，量取，加入锥形瓶中，在微波炉中加热溶解直至溶液变清，制得的琼脂糖溶液待溶液冷却到左右，加入溴化乙锭，使其终浓度为，混匀将凝胶倒入凝胶槽中，放置梳子待凝胶完全凝固后，将凝胶槽放入盛有缓冲液的电泳槽中，缓缓垂直拔出梳子，凝胶应完全被缓冲液覆盖，般没过胶面约取扩增产物与上样缓冲液混匀，用加样枪依次加入凝胶样品孔中，以为标准盖上电泳槽，接通电源，以的电压进行电泳电泳结束后，用全自动凝胶成像分析系统观察结果，拍照保存。

温州医学院硕士学位论文阳性产物测序与目的片段大小相符的阳性产物由北京华大基因公司纯化后进行正反向双向测序，测序结果先在本地数据库比对，然后再在中用进行比对分析。

比对有差异的序列用软件递交至。

质粒接合转移试验参照王明贵等的方法，以大肠埃希菌对叠氮化钠耐药为接合实验受体菌，以基因阳性菌株为供体菌。

方法为取对数生长期的供体菌及受体菌各加到新鲜液体培养基中过夜培养。

接合子以胰蛋白胨大豆琼脂平板筛选，根据供体菌及受体菌的药敏结果确定筛选平板中药物的浓度，筛选平板中含叠氮化钠及复方新诺明甲氧苄啶磺胺甲噁唑，氯霉素庆大霉素或四环素中的种，置孵育。

在筛选平板上生长的菌落同时接种至含及不含环丙沙星的平板上，以了解基因是否同时转移。

为进步确证供体菌的耐药基因是否传递到受体菌，提取接合子进行对应基因的扩增。

接合转移实验判断标准见表。

表接合转移实验判断标准接合转移实验供体菌受体菌接合子阳性不生长不生长生长阴性不生长不生长不生长失败供体菌或受体菌有种生长生长琼脂稀释法检测菌株对喹诺酮类药物的值用推荐的琼脂稀释检测临床分离菌株对环丙沙星诺氟沙星左氧氟沙星萘啶酸的值。

不同浓度抗菌药物制备按照规定的药物的溶解剂和稀释剂表，以及稀释方法配制不同浓度的抗菌药物，抗菌药物需提前取出在室温下平衡后再称量，药物配好后过滤除菌。

稀释方法如表。

含药琼脂平板的配制琼脂按说明书规定配制时加水量要减少，以备留给补充稀释好的药物用，溶解后高压蒸汽灭菌。

分别取不同浓度抗菌药物加入直径为的无菌平板内，再取高压蒸汽灭菌后冷却至的琼脂加入平板内，使药物和培养基充分混合均匀。

温州医学院硕士学位论文表药物标准品的溶解剂和稀释剂抗菌药物溶解剂稀释剂水水体积水，逐滴加入至溶解水体积水，逐滴加入至溶解水体积水，逐滴加入至溶解水表琼脂稀释法测药物稀释方法起始浓度药物体积稀释剂体积中间浓度终浓度贮存液细菌接种待测菌在血琼脂平板上过夜培养后，用比浊仪调菌液至麦氏浓度，再以稀释成为，接种时取稀释好的菌液约最终接种量为点接种至含抗菌药物的系列平板中。

接种顺序是先接种无药对照平板，而后从低药物浓度向高药物浓度平板。

琼脂平板接种好菌液后，将平板置室温待菌液被琼脂吸收后般不超过把琼脂平板倒置放入孵箱孵育，观察结果。

结果判断将平板置于暗色无反光物体表面判读试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为，依据标准判断耐药或敏感表。

接种处出现单个菌落或模糊薄雾状可忽略不计。

如果出现有个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。

分类号单位代码学号硕士学位论文论文题目年间大肠埃希菌临床连续分离株耐药性变迁及质粒介导的喹诺酮类耐药基因研究研究生姓名学科专业临床检验诊断学类型科学型指导教师二年五月目录缩略词表中文摘要英文摘要前言第部分年间大肠埃希菌临床感染分布及耐药性变迁材料和方法结果分析与讨论第二部分大肠埃希菌临床连续分离株中质粒介导的喹诺酮类耐药基因研究材料和方法结果分析与讨论小结正文参考文献附录致谢综述及参考文献独创性声明温州医学院硕士学位论文缩略词表缩写英文全称中文全称临床实验室标准化研究所最低抑菌浓度敏感中介耐药聚合酶链反应三磷酸脱氧核苷环丙沙星左旋氧氟沙星诺氟沙星萘啶酸氨基酸喹诺酮类药物耐药决定区质粒介导的喹诺酮类耐药超广谱内酰胺酶胰蛋白胨大豆琼脂温州医学院硕士学位论文年间大肠埃希菌临床连续分离株耐药性变迁及质粒介导的喹诺酮类耐药基因研究摘要目的了解温州医学院附属第医院年间临床分离大肠埃希菌的分布情况及耐药特性，为临床抗菌药物选择提供依据。

研究年每年月不依赖耐药背景的大肠埃希菌临床连续分离株中质粒介导的喹诺酮类耐药基因的分布与变迁情况及其与喹诺酮类抗菌药物耐药的相关性。

研究质粒介导的喹诺酮类耐药基因的多态性和遗传变异规律。

方法回顾性调查年间临床分离大肠埃希菌的临床感染分布特点，分析大肠埃希菌的耐药性及变迁情况。

筛选质粒介导的喹诺酮类耐药基因，阳性产物进行测序以确定基因型接合转移试验探讨质粒介导的喹诺酮类耐药基因的转移性琼脂稀释法测临床分离菌株，法测受体菌接合子，分析耐药基因与耐药性的关系。

运用生物信息学方法分析质粒介导的喹诺酮类耐药基因的多态性和遗传变异规律。

结果本研究中株大肠埃希菌主要来源于尿液标本，占，其次为脓液痰液和血液等临床常用抗菌药物中，敏感性最好的为亚胺培南敏感率为，其次为哌拉西林他唑巴坦敏感率为和头孢他啶敏感率为，但头孢他啶耐药性具明显上升趋势耐药率最高的为氨苄西林不敏感率达，其次为复方新诺明不敏感率为庆大霉素妥布霉素环丙沙星左旋氧氟沙星头孢曲松均处于较高耐药水平不敏感率均在以上的检出率高达。

温州医学院硕士学位论文年株大肠埃希菌临床连续分离株中，对环丙沙星的不敏感率分别为，对左氧氟沙星的不敏感率分别为，从年开始即处于较高耐药水平，耐药现象严重。

株大肠埃希菌中共检出基因阳性菌株株，检出率为，其中两株同时携带，基因基因分别检出株，株，株经比对分析，基因型包括未检出，基因。

基因均最早在年的标本中检出的基因阳性菌株对环丙沙星敏感，最低仅。

接合转移试验成功株，接合子对喹诺酮类药物的均有不同程度的提升，大部分呈低水平耐药，但其中株接合子呈现高水平耐药。

株大肠埃希菌中，基因阳性菌株为株，阳性率为，从株阳性菌株中随机选取株进行测序比对，其中株为，株为的变异株，其余株均为野生型。

基因最早在年标本中检出在环丙沙星敏感和耐药菌株中，产和不产菌株中的分布无统计学差异的基因阳性菌株对环丙沙星敏感，最低仅。

接合转移试验成功株，接合子对环丙沙星和诺氟沙星均有不同程度的提升，对左旋氧氟沙星无影响。

本研究株大肠埃希菌中未检出基因。

基因阳性菌株中，测得的序列与中已登录的基因家族序列同源，不存在突变株。

在测序的株基因阳性菌株中，株为突变株，分为种亚型，以为参照序列，涉及到的多态位点有处，所有序列均已递交至登录号为，。

基因存在两个相对保守区两个易变异区变异频率最高的为位氨基酸，其次为位氨基酸。

种类型的突变株与基因亲缘关系均较近。