变体的鉴定以及生物信息学分析实验材料试剂与仪器实验材料实验试剂实验仪器实验方法质体酪蛋白激酶缺失突变体降低敏感性和耐热性的研究种子的春化与播种基因组提取总提取逆转录模板的检测实时荧光定量三引物法鉴定纯合子和纯合子的验证实验结果三引物法鉴定纯合子和纯合子的验证基因的生物信息学分析本章小结第章质体酪蛋白激酶缺失突变体降低敏感性的研究实验材料试剂与仪器实验材料实验试剂实验仪器实验方法种子的春化萌发率处理气孔失水率的测量和干旱胁迫处理內源含量的测定影响下根长的测量基因和信号通路相关基因的表达实验结果和甘露醇胁迫下野生型和突变体种子萌发率比较野生型和突变体植株的叶片气孔失水率和內源含量的测定野生型和突变体在外源响应下的根长变化基因和信号通路相关基因的表达分析讨论本章小结第章质体酪蛋白激酶缺失突变体降低耐热性的研究实验材料试剂与仪器实验材料实验试剂硕士学位论文实验仪器实验方法种子的春化与播种幼苗存活率和种子萌发率根长和下胚轴的热胁迫处理脯氨酸和丙二醛的提取与含量测定热胁迫引起基因和热诱导基因表达的变化实验结果热胁迫后的萌发率与存活率热胁迫后根长和下胚轴长度的变化脯氨酸和丙二醛的提取与含量测定热胁迫引起的基因和热诱导基因表达的变化讨论本章小结第章质体蛋白激酶调控细胞核叶绿体逆行信号通路实验材料试剂与仪器实验材料实验试剂实验仪器实验方法逆行信号途径中关键基因和靶基因的表达分析生物量的相对分析以及叶绿体超微结构观察实验结果逆行信号途径中关键基因和靶基因的表达分析生物量的相对分析以及叶绿体超微结构观察讨论本章小结结论参考文献附录致谢质体酪蛋白激酶缺失突变体降低敏感性和耐热性的研究插图索引图拟南芥家族基因系统进化树图同工酶结构示意图图四聚体结构剖面图图线粒体逆向调节通路基因表达的动态相互作用示意图图在植物生长发育过程中的角色图，和组成的细胞核叶绿体逆行信号通路图家族和亚基基因的定位和组织表达情况图质体蛋白激酶的底物和质体信号通路图插入基因示意图图插入突变体,和纯合子的三引物鉴定图在和基因上的插入位点示意图和基因在野生型和突变体中表达水平图拟南芥基因时空表达特异性图拟南芥基因启动子顺式调控元件的分析图气孔大小测量示意图图不同浓度的外源,和处理野生型和突变体种子萌发率统计图野生型和突变体幼苗或植株中的气孔开放度，內源含量，基因的表达和叶片失水率测量和统计图野生型和突变体幼苗在不同浓度处理下根长的变化图未处理和处理下幼苗中,基因以及信号通路下游基因的表达分析图野生型和突变体在热胁迫下的存活率图热胁迫处理和未处理的野生型和突变体幼苗的根长和下胚轴长度变化图脯氨酸标准曲线的绘制图野生型和突变体植株叶片中的基因的转录，在突变体中，发现调控的质体基因的表达量下降。最近，研究者在叶绿体逆向信号通路中又发现了种新的重要的成分，属于三角状重复五肽，蛋白家族，推测其可能是连接到对叶绿体信号通路的产生具有重要意义的叶绿体转录物上。与其他的蛋白共定位并且具有连接到上的功能，这说明了在种条件下参与了质体基因转录的调控。和是复合体的组成成分，它们的缺失会导致部分质体编码基因的表达量的下降基因转录分析表明缺失导硕士学位论文致基因的表达模式和林可霉素引起的表达模式具有很高的相似性。研究发现在缺失突变体和中扮演了极其重要的作用。在缺失突变体中，相对野生型，基因的表达量下降。近期，可能连接和叶绿体逆向信号通路的重要枢纽转录调节子的鉴定，是个叶绿体膜复合物蛋白，年，等发现，当用启动叶绿体逆向信号通路的外界刺激时，会被从质体包膜上释放出来，积累在细胞核里直接激活的基因表达。在缺失突变体中，的表达量受到下调。当细胞受到刺激时,和在细胞核和叶绿体之间的信号传递起到了重要的作用，共同组成了叶绿体细胞核逆向通路图。有关它们之间具体是如何调控，还有待进步研究。图,和组成的细胞核叶绿体逆行信号通路质体蛋白激酶的研究现状在哺乳动物和酵母中，家族研究的较早，并且对其功能的了解较为全面。然而植物中的研究比较迟，近些年来，随着生物技术的突飞猛进，越来越多的亚家族的研究被报道，例如，拟南芥类蛋白中和的植物体内功能研究已有报道，主要是影响拟南芥生物钟的调节。目前有关质体蛋白激酶的功能研究较少，主要是对其亚细胞定位，组织表达和磷酸化等方面。质体酪蛋白激酶缺失突变体降低敏感性和耐热性的研究已经报道拟南芥基因组中编码亚基的基因总共有个个亚基和和个亚基和。年，等证明拟南芥亚家族中的个基因中，除了和基因以外，有对基因显示出倒置重复。除了,定位在细胞核中，编码亚基的基因主要也定位在细胞核中。实验证明有个定位到叶绿体的功能域。同时也做了这个亚家族基因在花，根，茎和叶中的表达情况图。图家族和亚基定位和组织表达情况硕士学位论文至今有关叶绿体酪蛋白激酶的研究较多的主要是在磷酸化叶绿体蛋白方面。除了在拟南芥中的亚基，其他植物物种中也有该亚基，并命名为质体转录激酶，或者。年，等证明了主要是定为在叶绿体的基质上，是基质发生的磷酸化的主要激酶。然而，至今有关该蛋白的部分底物被实验证明了，其中就包括了质体编码的聚合酶复合体的成分和连接蛋白叶绿体拟核相关蛋白和叶绿体酶复合体的底物等。年，等通过对叶绿体光合蛋白数据分析发现在叶绿体内可能含有个蛋白位点，主要包括多核苷酸转核苷酰酶转录激活染色体，亚基和类囊体相关激酶图。年，等证明通过叶绿体细胞核逆向通路来调节细胞核编码的光合蛋白的表达。在叶绿体内，和均是通过氧化还原反应来调节激酶活性。年，等证明了叶绿体中具有连接启动子和转录调控功能的蛋白能够被磷酸化，体内试验证明其磷酸化位点主要是在。年，等研究发现亚基缺失突变体的萌发率和子叶率比野生型高，这说明了具有调节信号通路的功能，但有关其具体的地位和作用具体目前尚未清楚。研究发现的底物参与的叶绿体细胞核逆向信号通路中包括信号通路中的信号分子。之前在哺乳动物中，和等研究了是否有热响应功能，结果显示热胁迫能够诱导的重新定位和活性的激活。能够磷酸化并且的过表达能够激活的活性。然而，关于植物中的在热胁迫过程中参与反应尚未报道。然而，最近有报道叶绿体细胞核逆向信号通路已经被鉴定在热胁迫诱导和分子表达的信号通路中扮演了重要的作用。年，等发现叶绿体核蛋白的抑制表达会导致核基因和目标基因表达量的下降，导致抗性的减弱。所以调控细胞核基因是通过逆向途径来实现的。前面的实验已经证明具有磷酸化的功能并且可以调控叶绿体的基因表达。说明可以通过其磷酸化的底物来调控细胞核基因的表达，结合生物信息学对基因启动子的分析热激等胁迫和等激素相关调控元件，可能会通过逆向通路来参与胁迫热胁迫信号通路和激素信号通路。质体酪蛋白激酶缺失突变体降低敏感性和耐热性的研究图的底物和质体信号通路本论文的目的意义以及内容本论文的研究目的是探究拟南芥在信号通路和热胁迫信号通路中扮演的角色。其中是拟南芥酪蛋白激酶亚家族中的员。在植物体中分布较为广泛，近年来成为研究的热点。研究结果表明，其参与了细胞周期，昼夜节律和种子贮藏，抗逆境等生理过程。目前对整个拟南芥家族成员的功能研究的报道尚不多见，所以本课题的开展将会增加学者们对这个家族成员功能的进步认识，为今后对这个家族其他成员的研究提供了重要的理论依据和方法。本论文较为全面研究了基因如何响应和热胁迫。可以结合目前的研究成果并合理利用现代生物技术，然后将其运用到生产实践中去，对提高农作物的产量和质量具有重大意义。本课题的研究内容将包括如下几方面利用生物信息学技术对基因的启动子和时空表达情况进行分析。利用三引物法鉴定并分离出个基因缺失的单突变体和两个双突变体和，比较了突变体和野生型幼苗或植株在和热胁迫处理后引起的相关表型及生理指标的比较分析。比较分析了野生型和突变体植株的生长情况生长参数以及叶绿体的亚显微结构。利用定量分析了和基因在和热胁迫下的表达模式比较分析了突变体和野生型中信号通路和热信号通路中相关基因及叶绿体细胞核逆向途径中关键基因的表达水平的变化。硕士学位论文第章质体酪蛋白激酶缺失突变体的鉴定以及生物信息学分析目前有关植物基因功能的研究主要包括通过基因克隆技术获得过表达体系植株利用插入目的基因获得敲出突变体利用干扰技术获得基因沉默突变体。插入突变体在方向遗传学上的应用具有明显的优势，已经成为研究的主要手段。进行表型研究，我们通过三引物法获得插入突变体的纯合子。其实验原理模式图如下图图插入基因示意图三引物法鉴定纯合子原理三引物法即采用三个引物和进行扩增。均未插入野生型植株，两条染色体上的目的基因，因此仅有种产物，约的分子量到均插入含有目的基因的条染色体上，则为纯合突变体植株，。而本身的长度大概为的插入模板会阻抑目的基因的特异性扩增产物形成，因此获得了种以和或，根据在基因上插入的方向选择为对引物扩增形成的产物，分子量约即从或到插入位点片段，长度大概是，再加上从插入位点到载体左边界片段，长度大约为杂合子突变体的植株，只会出现在目的基因的条染色体上发生的插入，所以扩增后的产物有和这两种。电泳结果差异明显如图，能有效区分不同基因型的植株。硕士学位论文学校代号学号分类号密级硕士学位论文质体酪蛋白激酶缺失突变体降低敏感性和耐热性的研究学位申请人姓名培养单位生物学院导师姓名及职称学科专业生物化学与分子生物学研究方向植物分子遗传学论文提交日期质体酪蛋白激酶缺失突变体降低敏感性和耐热性的研究学位论文原创性声明和学位论文版权使用授权书湖南大学学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的论文是本人在导师的指导下进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名日期年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于保密,在年解密后适用本授权书。不保密。请在以上