限公司稳压稳流电泳仪南京普惠生物技术有限公司美国热电微量高速离心机美国热电公司全自动微生物分析仪法国生物梅里埃公司脉冲场凝胶电泳仪公司主要培养基和溶液温州医学院硕士学位论文主要培养基血平板称取哥伦比亚血琼脂干粉，加入蒸馏水，高压灭菌后冷却至至，加入羊血，混匀后倾注于无菌平皿中，进行无菌试验，冷藏备用。平板称取琼脂干粉，加入蒸馏水，高压灭菌，冷却至到，倾注于无菌平皿中，厚度为，进行无菌试验，合格后冷藏备用。液体培养基称取胰蛋白胨酵母提取物和氯化钠，加入去离子水混匀充分溶解，用调至，定容至，高压灭菌后冷藏备用。主要溶液碱，冰乙酸蒸馏水定容至。蒸馏水定容至，调至，高压灭菌。缓冲液去氧胆酸，十二烷基肌氨酸钠，蒸馏水定容至，调至，高压灭菌。，硼酸蒸馏水定容至。溴化乙锭在中加入，混合至完全溶解，铝箔包裹管，保存。方法耐万古霉素肠球菌的初筛采用含有万古霉素的琼脂筛选平板，挑取培养小时的菌落，用无菌生理盐水调浊度至麦氏单位，吸取滴加与含有万古霉素的琼脂平板上，孵育小时，观察有菌落生长者为耐万古霉素肠球菌。耐万古霉素肠球菌对常用抗菌药物的耐药性检测，具体操作如下制备不同浓度的抗菌药物溶液各种药物溶剂和稀释剂参考规定。提前取出药物粉末平衡至室温，迅速称量。配药药物后过滤除菌，配成所需总浓度，倍比稀释。制备含药平板琼脂粉按说明书计算好之后称取，终浓度考虑总体积要包括稀释好的药液的体积，溶解后高压灭菌，与稀释好的药液混合倒入直分类号单位代码学号硕士学位论文论文题目肠球菌毒力基因和万古霉素耐药基因研究研究生姓名学科专业临床检验诊断学类型科学型指导教师二三年三月温州医学院硕士学位论文论文题目肠球菌毒力基因和万古霉素耐药基因研究答辩委员会主席答辩委员会成员论文答辩日期年月日温州医学院硕士学位论文目录缩略词表中文摘要英文摘要前言第部分屎肠球菌和粪肠球菌临床感染分布及毒力基因携带情况分析材料和方法结果分析与讨论第二部分耐万古霉素肠球菌耐药基因检测及其流行病学研究材料和方法结果分析与讨论小结正文参考文献附录致谢综述及参考文献独创性声明温州医学院硕士学位论文缩略词表缩写英文全称中文全称耐万古霉素肠球菌临床实验室标准化研究所美国模式菌种收集中心最低抑菌浓度聚合酶链反应重症监护病房三磷酸脱氧核苷呋喃妥因莫西沙星青霉素氨苄西林左氧氟沙星肠球菌表面蛋白透明质酸酶明胶酶溶血素溴乙锭脉冲场凝胶电泳多位点序列分型温州医学院硕士学位论文肠球菌毒力基因和万古霉素耐药基因研究摘要目的了解温州医学院附属第医院年至年年间临床分离屎肠球菌和粪肠球菌的标本类型分布情况及其对各种抗菌药物的耐药性。统计分析各种标本来源肠球菌之间毒力基因携带率的差异，为进步研究肠球菌致病机制和毒力基因作用机制奠定基础。了解耐万古霉素肠球菌耐药基因特点及表型特点，并对其水平传播特性进行研究。对耐万古霉素肠球菌进行流行病学调查研究。方法回顾性调查年至年临床分离的屎肠球菌和粪肠球菌的标本来源分布情况，统计分析两种肠球菌对各种抗菌药物的耐药情况。的方法筛查肠球菌毒力因子基因，并与菌株来源结合进行统计学方差分析，找出二者对应联系。用的方法对肠球菌进行基因筛查，检测万古霉素耐药相关基因和毒力因子基因。通过接合转移试验观察耐药基因的水平转移能力，检测接合子的最低抑菌浓度，同时用的方法验证结合实验是否成功。用脉冲场凝胶电泳和多位点序列分型方法对耐万古霉素的肠球菌进行同源性分析，了解其流行病学特点。结果株肠球菌包括屎肠球菌株和粪肠球菌株分离自温州医学院附属第医院临床送检的各类标本，其中来自尿液标本株占，痰液标本株占，粪便标本株占，引流液创面脓液血液等标本株占。药敏结果显示屎肠球菌对青霉素氨苄青霉素左氧氟沙星和莫西沙星耐药率均达在以上其对呋喃妥因莫西沙星青霉素氨苄青霉素氨基糖苷类和喹诺酮类药物的耐药率都要明显高于粪肠球菌屎肠球菌和粪肠球菌对利奈唑胺万古霉素和替考拉宁，二者敏感率都在以上。分离自尿液标本的菌株和三种毒力基因的携带率要高于粪便标本来源的菌株，分离自痰液标本菌株携带率也高于粪便标本来源菌株，而分离自尿液标本的菌株携带率高于痰液标本来源菌温州医学院硕士学位论文株，基因在不同标本来源的菌株中检出率无明显差异。株肠球菌中共检出株，其中株为屎肠球菌。所有对临床常用抗菌药物大部分表现为耐药。对糖肽类药物万古霉素呈高水平耐药，对替考拉宁由等人在肠球菌中发现的，基因是段在感染相关菌株中检出率较高的的基因片段，目前被认为促进粘附定植生物膜的形成和逃避免疫系统，并在抗菌药物耐药性中起定的作用。这些都证明了基因与其致病性有着紧密的关联性。溶血素是种细菌毒素，基因簇的产物具有溶血活性和杀菌活性，对真核和原核细胞都有杀伤作用。在肠球菌毒力因子中，水解酶包括有透明质酸酶白明胶酶和丝氨酸蛋白酶等，透明质酸酶作用于透明质酸，可以解聚结缔组织的黏多糖，从而促进肠球菌及其毒素在宿主组织内的散布。透明质酸酶由染色体上的基因编码。在肠球菌致病机制中，白明胶酶的主要作用为掠取宿主营养供给细菌，另外在生物膜的形成过程中也起定的作用，生物膜的形成可以使细菌的感染更加持久，呈慢性趋势。编码白明胶酶的基因定位于染色体上，按照细胞密度依耐性的方式起作用。本次研究中我们分别对不同来源的肠球菌毒力基因分别进行统计学分析，结果发现在尿液标本中和这三种毒力基因的携带率要高于粪便标本来源的细菌，痰液标本来源菌株中携带率也高于粪便标本来源菌株，而基因在各个标本来源的菌株中的检出率无明显差异，另外，尿液标本来源菌株中携带率还高于痰液标本来源菌株。肠球菌致病的基本过程般为体内定植的菌群异位，引起的病理损害从而导致了临床感染症状，由于生理结构的原因，尿路感染为临床上肠球菌感染最为普遍的部位，异位的肠球菌为了防止尿液的冲刷需要更强的黏附能力才能黏附并定植并于这种新的环境中，基因的存在为肠球菌的定植提供了有力的保护。和促进生物膜的形成，使细菌感染呈慢性持久状态，有利于细菌耐药性的获得和增强，强化了肠球菌定植于尿路并引起临床症状的作用。具有的溶白细胞作用在呼吸道感染中增强了其致炎致病的作用，通过降解宿主组织和调节免疫应答发挥其在尿路感染中的作用，这可能也成为肠球菌导致的感染中尿路感染居于首位的原因之。总而言之，临床上分离到的非肠道部位的肠球菌的毒力基因携带率要高于分离自粪便标本的菌株，方面是因为肠球菌在这些非正常寄居部位定植需要更强大的生存能力，这些毒力因子为其提供了这种生存的条件，温州医学院硕士学位论文同时，毒力因子的存在也减弱了机体在这些部位的免疫防御能力，使得定植的肠球菌能够黏附聚集并扩散开，引起相应的临床症状。肠球菌的毒力因子众多，且毒力因子常与肠球菌的耐药基因之间还存在些联系。各毒力因子基因相互之间的关系和其作用机制及其与宿主之间的相互作用还不明确，本研究提示在临床分离的肠球菌中非正常寄居部位分离的菌株的毒力基因携带率要明显高于正常寄居部位胃肠道分离到的菌株，造成这现象的原因可能与异常寄居部位具体环境有关，更详细的肠球菌毒力基因发挥作用方式与寄居部位相互作用机制还有待于更进步的研究。温州医学院硕士学位论文第二部分耐万古霉素肠球菌耐药基因检测及其流行病学研究糖肽类抗生素是类针对革兰阳性菌，尤其是革兰阳性球菌有强大杀菌作用的抗菌药物，临床上常把万古霉素和替考拉宁作为革兰阳性菌尤其是葡萄球菌肠球菌和肺炎链球菌所致严重感染的最后防线。年人们从链霉菌的培养液首次分离出第个糖肽类抗生素万古霉素。直到年，第株质粒介导的耐万古霉素的肠球菌才被发现并报导。的出现意味着在广泛应用糖肽类抗菌药物的情况下选择压力使得肠球菌在基因结构上有所变化。万古霉素可以诱导肠球菌产生种能修饰细胞壁前体肽聚糖的酶，使万古霉素类不能再结合到前体肽聚糖末端的丙氨酰丙氨酸而产生耐药性。目前已发现的有种类型和。其中为主要类型，此型耐药株对万古霉素和替考拉宁的耐药水平较高，可诱导和转移。基因簇位于转座子上，属于家族，存在于革兰阳性菌的质粒上，通过接合和转座造成耐药性的播散。等对屎肠球菌的耐药质粒进行研究，发现的共编码种多肽，他们共同作用使细菌对糖肽类抗生素产生了耐药性。有关细菌对万古霉素耐药的研究报道国外已有不少，但国内由于目前检出的耐万古霉素菌株数量所占临床耐药菌的比例不大，所以相应的文献也较少，耐万古霉素肠球菌的基因型和表型特点各国各地区报导的也有差异，为了解我院的耐万古霉素肠球菌耐药基因型和表型以及水平传播特性，我们对检测到的菌株进行研究，并分析其和类型，了解的流行病学特点。材料和方法材料菌株来源株耐万古霉素肠球菌均来源于第部分标本。所有菌株均经型全自动微生物分析仪鉴定到种。质控菌株及参考菌株药敏试验质控菌株粪肠球菌购自卫生部临检中心接合试验受体菌和脉冲场凝胶电泳分子量标准菌株由浙江大学附属邵逸夫医院俞云松教授惠赠。抗菌药物万古霉素四环素青霉素左氧氟沙星利福平替考拉宁利奈唑胺等抗菌药物标准品购自中国药品生物制品检定所。试剂及凝胶电泳试剂同第部分。温州医学院硕士学位论文脉冲场凝胶电泳试剂上海生工上海生工上海生工上海生工公司去氧胆酸上海生工十二烷基肌氨酸钠上海生工硼酸上海生工冰醋酸上海第试剂厂溴化乙锭公司溶菌酶上海衡泽生物技术有限公司蛋白酶公司限制性内业的搭接宽度,平行路轴线方向不得小于米,垂直路轴线方向不得小于米各段应设立标志,以防漏压欠压和过压。碾压机械行走方向应平行于路轴线严格按碾压试验确定的参数施工。已铺土料表面在压实前被晒干或含水