止期平台期细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制接触抑制密度依赖性培养细胞生长的条件细胞的营养需要细胞的生存环境温度←←渗透压无污染无毒实验准备实验用品仪器超净工作台压力蒸汽消毒器电热干燥箱培养箱倒置显微镜自动双重纯水蒸馏器纯水仪离心机天平水浴箱液氮罐冰箱酸度计滤器酸缸耗材培养瓶吸管电动吸引器培养板冻存管等超净台超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。

净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。

滤器培养箱培养箱设定的条件为，。

使用培养箱培养细胞时应注意的问题用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。

保持培养箱内空气干净。

定期消毒酒精擦拭。

箱内放置蒸馏水于蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。

自动双重纯水蒸馏器纯水仪培养板培养瓶清洗与消毒清洗玻璃器皿新浸泡刷洗浸酸冲洗旧用后立即浸入水中，及时冲洗。

胶塞煮沸冲洗稀盐酸冲洗塑料器皿浸泡过夜冲洗稀态监测。

吸去胰蛋白酶液，加入含血清的培养液。

用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。

计数，接种于新的培养瓶内。

细胞计数血细胞计数板将计数板和张盖玻片擦拭干净，把盖玻片覆在计数板上面，使之稍微移向侧，露出部分计数板台面，以便滴加细胞悬液。

染色取细胞悬液滴，台盼蓝滴，混匀。

加悬液把计数板平放在显微镜台上，立即从计数板边缘轻轻滴滴已染色的细胞悬液。

镜下观察如图细胞数原悬液大格细胞总数稀释倍数细胞计数细胞冻存和复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。

细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。

冻存和复苏的原则慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。

如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜细胞器的损伤和破裂。

复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。

慢冻程序标准程序当温度在以上时，当温度达以下时，当温度达时，可迅速放入液氮中细胞冻存器简易程序将冷冻管管口要朝上放入纱布袋内，纱布袋系以线绳通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口直接投人液氮中。

细胞冻存方法预先配制冻存液含血清培养基取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液细胞加入细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。

细胞复苏方法从液氮中取出冷冻管，迅速投入水浴中，使其融化分钟左右。

分钟内用培养液稀释至原体积的倍以上。

低速离心分钟。

去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。

细胞培养的污染微生物真菌细菌支原体和病毒化学物影响细胞生存的非细胞所需成分细胞非同种的其他细胞来源不洁的动物组织标本空气清洗与消毒操作血清细胞培养污染的鉴别细菌真菌污染的检测肉眼观察细菌真菌污染常在传代换液加样等开放性操作后发生，而且增生迅速，若有污染，在小时内可明显观察到。

如培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起。

镜下观察在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。

若细胞之间有丝状管状树枝状或卵形的物质为真菌污染。

接种观察支原体污染的检测相差显微镜观察用相差油镜观察，支原体呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见类似于布朗运动的表现。

应注意于细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。

低涨处理地衣红染色观察荧光染色法观察电镜检测培养检测细胞培养污染的预防控制预防消毒灭菌规范操作防止细胞交叉污染清除使用抗生素加温处理使用支原体特异性血清细胞培养基本技术徐州医学院神经生物研究中心王婷细胞培养的基本概念体外培养细胞培养使用单个细胞悬液组织培养使用组织块立方毫米或薄片厚毫米器官培养使用器官原基或器官的部分或整个器官培养细胞的生命归宿原代培养期传代期衰退期培养细胞的特性培养细胞的生长方式贴附生长必须贴附于支持物表面才能生长。

悬浮生长于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。

每代贴附生长细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期平台期游离期细胞接种后在培养液中呈悬浮状态。

也称悬浮期。

此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。

分钟小时贴壁期细胞附着于底物上，游离期结束。

细胞株平均在分钟小时贴壁。

底物胶原玻璃塑料其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素胶原等糖蛋白生长基质，这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子附着。

进口塑料培养瓶涂有生长基质化学合成的功能基团潜伏期此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。

细胞株潜伏期般为小时。

对数生长期细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。

停止期平台期细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制接触抑制密度依赖性培养细胞生长的条件细胞的营养需要细胞的生存环境温度←←渗透压无污染无毒实验准备实验用品仪器超净工作台压力蒸汽消毒器电热干燥箱培养箱倒置显微镜自动双重纯水蒸馏器纯水仪离心机天平水浴箱液氮罐冰箱酸度计滤器酸缸耗材培养瓶吸管电动吸引器培养板冻存管等超净台超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。

净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。

滤器培养箱培养箱设定的条件为，。

使用培养箱培养细胞时应注意的问题用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。

保持培养箱内空气干净。

定期消毒酒精擦拭。

箱内放置蒸馏水于蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。

自动双重纯水蒸馏器纯水仪培养板培养瓶清洗与消毒清洗玻璃器皿新浸泡刷洗浸酸冲洗旧用后立即浸入水中，及时冲洗。

胶塞煮沸冲洗稀盐酸冲洗塑料器皿浸泡过夜冲洗稀盐酸冲洗包装牛皮纸棉布铝饭盒消毒紫外线消毒湿热消毒高压蒸汽消毒滤过消毒大多数培养用液，如人工合成培养基血清酶液等均采化学消毒新洁尔灭酒精细胞培养用液及配制水新鲜配置的双蒸水或去离子水平衡盐溶液无的缓冲液加水至消化液胰蛋白酶胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接