传播多种病原体，例如细菌性痢疾伤寒肝炎等疾病，国内的研究结果也表明，德国小蠊能携带痢疾杆菌绿脓杆菌变形杆菌沙门杆菌伤寒杆菌和寄生虫卵等病原体。

而且德国小蠊是最主要的引起变态反应的蟑螂之，其体壁分泌物排泄物虫卵尸体蜕皮碎屑等经吸入人体，从而使有过敏体质的患者出现皮疹哮喘和打喷嚏等症状，是重要的过敏原，可引起Ⅰ型变态反应。

过敏性疾病是临床上的常见病和多发病，并有逐年增多趋势，引起人们的关注，蟑螂是主要的吸入性变应原之，可导致哮喘及其它过敏性疾病。

目前，临床上对蟑螂过敏原患者进行体内外诊断和特异性免疫治疗时，仍广泛使用蟑螂粗浸液，但粗浸液中含有大量非致敏组分，稳定性差，难以标准化。

故整个蟑螂虫体浸出液用于变态反应疾病的诊断和脱敏治疗存在许多不足，而蟑螂重组变应原很好的解决了这些问题。

因此，获得编码德国小蠊过敏原的基因就尤为重要。

蟑螂的主要变应原已陆续被鉴定和克隆。

截至年月日，国际免疫学会联合会收录的德国小蠊变应原有微肠绒毛同源蛋白天冬氨酸蛋白酶载脂蛋白谷胱甘肽转移酶肌钙蛋白原肌球蛋白及肌球蛋白轻链。

其中，德国小蠊过敏原基因的克隆及原核表达种德国小蠊变应原被克隆表达并鉴定出免疫学特性，而仅见上传序列序列不完整，缺少端，未见任何关于其变应原性分析及鉴定等的相关资料报道，其序列的完整性是否会影响其变应原性尚需进步对研究。

本研究利技术，获得编码德国小蠊变应原的完整序列。

利用和网站的在线软件对变应原进行分析，获得其有关生物信息学资料，利用软件预测该蛋白抗原表位。

为进步研制基因工程变应原用于临床诊断和免疫治疗奠定了基础。

材料与方法材料物种来源德国小蠊从上海生科院引种后，贵阳医学院生物学教研室长期繁殖饲养所得。

主要试剂氯化钙恒因生物琼脂糖恒因生物恒因生物硼酸乙二胺四乙酸恒因生物无水乙醇蔗糖两步法逆转录试剂盒琼脂糖凝胶回收试剂盒宝生物有限公司胰蛋白胨恒因生物德国小蠊过敏原基因的克隆及原核表达酵母浸出粉恒因生物低熔点琼脂糖恒因生物质粒小提试剂盒恒因生物标准甲叉丙烯酰胺丙烯酰胺甲醇甘氨酸盐酸溴酚蓝二甲苯吉氏染色剂十二烷基硫酸钠，二甲基甲醛胺考马斯亮蓝乙二胺四乙酸咪唑酶标抗酶标二抗封闭液底物显色剂甘油以上试剂未注明者均为国产分析纯。

主要仪器梯度仪，移液器，德国小蠊过敏原基因的克隆及原核表达低温冷冻离心机，磁力加热搅拌器，武汉精华科教仪器有限公司台式高速离心机，江苏太仓市医疗器械厂电热恒温水温箱型三用水箱，金坛市富华仪器有限公司净化工作台，苏州净化设备有限公司多用途水浴恒温振荡器，江苏太仓市实验设备厂微波炉，广东顺德市格兰仕电器实业有限公司双恒电泳仪，北京东方仪器厂琼脂糖凝胶电泳槽，北京六仪器厂电热鼓风恒温干燥箱，四川成都电烘箱厂旋涡混合机，江苏太仓市科教器材厂电子分析天平，仪，上海精科雷磁公司三恒电泳仪，北京六仪器厂蛋白凝胶电泳槽北京百晶生物技术有限公司凝胶成像系统，昆明纳瑞科技有限公司生物信息分析软件序列相似性检索软件序列结构及理化性质分析软件网站的功能检测的变应原性，通过软件预测该蛋白的抗原表位。

方法部分序列的获取在进行搜索获得德国小蠊变应原部分序列，但，端有缺失，是属于的肌球蛋白轻链。

获取全长序列，引物的设计根据已公布的德国小蠊变应原基因部分序列及引物设计要求设计出引物，由上海生工合成。

，所用引物序列如下德国小蠊过敏原基因的克隆及原核表达表所示表引物引物名称引物序列下游引物下游引物通用引物通用引物的淋巴细胞表面的抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答抗原也借表位与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合而发挥免疫效应。

本研究利用软件中的模块，对蛋白的亲水性柔韧性表面可及性及抗原性指数进行综合分析后，发现该蛋白有个潜在的抗原表位，该结果可以为寻找的最佳优势表位区给予很大的支持作用，同时也为该蛋白的单克隆抗体的制备和相关研究等提供了理论依据。

再次该结果进步证实了该序列编码的蛋白变应原性。

综上所述，本实验通过技术首次获得了德国小蠊过敏原的完整编码序列，首次成功构建了蛋白的原核表达载体，并在大肠杆菌中诱导表达出以可溶性形式为主的重组德国小蠊过敏原蛋白，应用免疫印迹法对其进行了分析和鉴定。

本文运用生物信息学的方法得到德国小蠊蛋白的结构信息及细胞表位信息，为德国小蠊蛋白的过敏性的深入研究和进步开展过敏性疾病免疫诊断和治疗奠定了信息基础。

德国小蠊过敏原基因的克隆及原核表达参考文献林启彬。

中国的蜚蠊昆虫化石。

昆虫学报。

，齐欣，孙耕芹。

德国小蠊生物学特性及综合治理。

中国媒介生物学及控制杂志。

刘国璋，何麟，我国人体寄生虫及病媒昆虫染色体研究概况中国寄生虫学与寄生虫杂志。

，马慧，刘志刚。

蟑螂重组变应原的研究进展。

热带医学杂志。

王邦俊，王强，张志刚，张劲松，李学刚。

利用技术扩增大豆抗病基因同源末端序列。

遗传。

王少丽，盛承发，乔传令。

末端快速扩增技术及其应用。

遗传。

赵英，牛建新。

利用和克隆新疆梨树苹果茎痘病毒末端序列。

园艺学报。

德国小蠊过敏原基因的克隆及原核表达李飞，韩召军。

棉蚜钠通道和基因组片段的克隆和序列分析。

武夷科学。

吴德，吴忠道，胡旭初，何东苟，黄艳，余新炳。

华支睾吸虫磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆表达和序列分析。

中国寄生虫病防治杂志。

满初日嘎，谢少林，杜丽，成鹰，张冬琳，王凤阳。

海南坡鹿的克隆及其生物信息学分析。

吉林农业大学学报，。

王安娜，王婵婵，吴蕾，李业成，刘成，马凤鸣。

大豆基因克隆及生物信息学分析。

东北农业大学学报。

寻萌，赵四海，曹春霞，薛欣，邵明明，李薇，徐琨，楚雍烈。

细胞角蛋白真核表达载体的构建表达及生物信息学分析。

细胞与分子免疫学杂志。

肖杰，吴序栎，王琳琳徐宏。

花生蛋白的生物信息学分析。

免疫学杂志。

严小玲，何颖，陶爱林，阮林，陈惠芳，邹泽红。

猫主要过敏原的二级结构及细胞抗原表位预测。

国际医药卫生导报。

李海侠，毛旭虎。

蛋白质抗原表位研究进展。

微生物学免疫学进展。

孙涛，程安春，汪铭书。

蛋白质细胞抗原表位测定方去的研究进展。

黑龙江畜牧兽医。

勾蓝图，杨金亮。

基于生物信息学的胞外区细胞表位预测。

免疫学杂志。

覃健，张志勇，何敏，等。

的生物信息学分析及其多克隆抗体制备免疫学杂志。

，德国小蠊过敏原基因的克隆及原核表达致谢五年的读书生活在这个季节即将划上个句号，而于我的人生却只是个逗号，我将面对又次征程的开始。

五年的求学生涯在师长亲友的大力支持下，走得辛苦却也收获满囊，在论文即将付梓之际，思绪万千，心情久久不能平静。

感谢所有与我共享阳光和快乐的同学，有你们的陪伴和支持，我的大学充实而精彩。

感谢我的大学，给了我学习和成才的机会。

感谢所有授我以业的老师，没有这些年知识的积淀，我没有这么大的动力和信心完成这篇论文。

本课题选题及研究过程学位论文都是在指导老师张老师王老师龙师姐的亲切关怀和悉心指导下完成的。

他们严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。

老师不仅在学业上给我以精心指导，同时还在思想生活上给我以无微不至的关怀，在此谨向老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。

我还要感谢在起愉快的度过毕业论文的同学们，正是由于你们的帮助和支持，我才能克服个个的困难和疑惑，直至本文的顺利完成。

感谢我的爸爸妈妈，养育之恩，无以回报，您们永远健康快乐是我最大的心愿。

感恩之余，诚恳地请各位老师对我的论文多加批评指正，使我及时完善论文的不足之处。

德国小蠊过敏原基因的克隆及原核表达中国图书资料分类法分类号单位代码学号贵阳医学院基础医学院届基础医学生物技术方向专业本科学位论文德国小蠊过敏原基因的克隆及原核表达学生杨应凤年级级专业基础医学医学生物技术指导教师张春林教授王赟讲师龙高群实习单位贵阳医学院生物学教研室年月日德国小蠊过敏原基因的克隆及原核表达目录摘要前言材料与方法材料物种来源主要试剂主要仪器生物信息学分析软件方法部分序列的获取获得全长序列引物的设计的准备及逆转录获得第链扩增及检测产物的纯化大肠杆菌感受态细胞的制备重组质粒的连接转化德国小蠊过敏原基因的克隆及原核表达阳性克隆的筛选菌液验证及取菌液测序拼接获得全长序列及搜索其全长克隆全长引物的设计扩增及纯化感受态细胞的制备连接及转化重组质粒的提取转化表达菌及阳性克隆的筛选全长序列的生物信息学分析及功能预测重组蛋白的表达与纯化诱导预表达检测重组蛋白可溶性的分析重组蛋白表达条件的优化重组蛋白的大量表达重组蛋白的纯化表达产物的检测结果分析扩增反应重组质粒转化鉴定结果德国小蠊过敏原基因的克隆及原核表达全长序列测序及生物信息学分析全长序列测序结果测序所得序列生物信息学分析变应原性的分析重组蛋白的预表达结果重组蛋白可溶性的分析结果重组蛋白的表达优化结果重组蛋白的时间诱导表达优化结果重组蛋白的浓度诱导表达优化结果重组蛋白的纯化重组蛋白纯化后的免疫印迹讨论与结论参考文献致谢德国小蠊过敏原基因的克隆及原核表达德国小蠊过敏原基因的克隆及原核表达学生杨应凤导师张春林王赟龙高群摘要目的克隆德国小蠊变应原的完整编码序列，并通过生物信息学预测其结构和功能成功原核表达德国小蠊重组变应原。

方法通过搜索，获得德国小蠊部分序列，通过技术获得编码的全长序列，采用生物信息学方法推导出该序列编码的氨基酸序列及其理化性质，并对其预测信号肽蛋白疏水性可溶性跨膜区结构二级结构三级结构及抗原表位。

结果获得编码德国小蠊变应原的完整序列，含编码个氨基酸，推测分子式为，并成功原核表达德国小蠊重组变应原。

结论本实验室首次获得德国小蠊过敏原基因的全长序列，通过生物信息学分析获得了该蛋白的分子特征，并预测了其结构和功能及抗原表位优势区域，为进步研究其变应原性奠定基础。

关键词德国小蠊变应原克隆表达生物信息学德国小蠊过敏原基因的克隆及原核表达前言蜚蠊目昆虫俗称蟑螂，隶属于节肢动物门昆虫纲蜚蠊目。

是世界上最古老的昆虫之，主要栖息于垃圾堆物落叶草丛以及石隙岩缝等多样的环境之中，具有极强的适应能力。

蟑螂因携带多种病原生物，机械性传播疾病，给人类的身体健康带来极大的危害，已被列为世界性的卫生害虫。

在我国主要以德国小蠊美洲大蠊日本大蠊澳洲大蠊黑胸大蠊为主，其中美洲大蠊与德国小蠊在我国分布广泛，对人类身体健康造成严重的威胁，是我国重要的卫生害虫。

蜚蠊不仅骚扰人类携带多种病原体，而且其粪便分泌物及尸体