割重组后可能丢失些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。限制酶和连接酶的关系限制酶和连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。限制酶不切割自身的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。连接酶起作用时，不需要模板。载体条件与目的条件目的稳定并能复制有个至多个限制酶切割位点具有特殊的标记基因作用作为运载工具，将目的基因导入宿主细胞内。利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。目的基因稳定存在且数量可扩大可携带多个或多种外源基因便于重组的鉴定和选择关于基因工程工具的几个易错点限制酶是类酶，而不是种酶。限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温强酸或强碱均易使之变性失活。在切割目的基因和载体时要求用同种限制酶，目的是产生相同的黏性末端或平末端。将个基因从分子上切割下来，需要切两处，同时产生个黏性末端或平末端。不同分子用同种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同个分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端般不相同。基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程的载体是分子，能将目的基因导入受体细胞内膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。基因工程中有种工具，但工具酶只有种。山东烟台市高三统考图表示含有目的基因的片段长度即碱基对和部分碱基序列，图表示种质粒的结构和部分碱基序列。现有ⅠⅠⅠⅠ种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为。请回答下列问题图的条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由连接。若用限制酶Ⅰ完全切割图中的片段，产生的末端是末端，其产物长度为。若图中虚线方框内的碱基对被碱基对替换，那么基因就突变为基因。从杂合子中分离出图及其对应的片段，用限制酶Ⅰ完全切割，产物中共有种不同长度的片段。脱氧核糖磷酸脱氧核糖平若将图中质粒和目的基因通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，般需要用添加的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因不能正确表达，其最可能的原因是。Ⅰ抗生素同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因与质粒反向连接解析条脱氧核苷酸链中相邻的两个碱基之间是通过“脱氧核糖磷酸脱氧核糖”相连的，要注意与两条脱氧核苷酸链的相邻碱基之间通过氢键相连进行区分。从Ⅰ的识别序列和切点可见，其切割后产生的是平末端，图中片段有Ⅰ的两个识别序列，故切割后产生的产物长度为和三种。图示方框内发生碱基的替换后，形成的基因失去了个Ⅰ的识别序列，故基因基因用Ⅰ完全切割后产物中除原有的种长度的片段外，还增加种的片段。目的基因的两端都有Ⅰ的识别序列，质粒的启动子后抗生素抗性基因上也有Ⅰ的识别序列，故应选用的限制酶是Ⅰ，此时抗生素抗性基因作为标记基因，故筛选时培养基中要添加抗生素。若重组质粒已导入了受体细胞却不能表达，很可能是因为用同种限制酶切割后，目的基因和质粒有两种连接方式，导入受体细胞的重组质粒是目的基因和质粒反向连接形成的。考点二基因工程的基本操作程序和应用目的基因的获取直接分离法从基因文库基因组文库或文库中获取利用技术扩增人工合成法化学合成法针对已知核苷酸序列的较小基因逆转录法以为模板，在反转录酶的作用下人工合成基因表达载体的构建基因表达载体的组成及作用基因表达载体的构建过程将目的基因导入受体细胞生物种类植物动物微生物常用方法受体细胞转化过程农杆菌转化法显微注射技术感受态细胞法体细胞受精卵原核细胞将目的基因插入到质粒的上转入农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的染色体上表达将含有目的基因的表达载体提纯取卵受精卵显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物处理细胞感受态细胞重组表达载体分子与感受态细胞混合感受态细胞吸收分子目的基因的检测与鉴定基因工程操作过程中的几个易错点目的基因的插入位点不是随意的基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。基因工程操作过程中只有第三步将目的基因导入受体细胞没有碱基互补配对现象第步存在逆转录法获得，第二步存在黏性末端连接现象，第四步存在检测分子水平杂交。农杆菌转化法原理农杆菌易感染植物细胞，并将其质粒上的转移并整合到受体细胞染色体上。目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。标记基因的种类和作用标记基因的作用筛选检测目的基因是否导入受体细胞，常见的有抗生素抗性基因发光基因表达产物为带颜色的物质等。受体细胞的选择受体细胞常用植物受精卵或体细胞经组织培养动物受精卵般不用体细胞微生物大肠杆菌酵母菌等。要合成糖蛋白有生物活性的胰岛素则必须用真核生物酵母菌需内质网高尔基体的加工分泌般不用支原体，原因是它营寄生生活定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是它无细胞核，也没有核糖体等细胞器，不能合成蛋白质。还应注意的问题有基因表达载体中，启动子片段起始密码子终止子片段终止密码子。基因表达载体的构建是最核心最关键的步，在体外进行。高考四川卷分将苏云金杆菌蛋白的基因导入棉花细胞中，可获得抗棉铃虫的转基因棉，其过程如下图所示注农杆菌中质粒上只有片段能转移到植物基因逆转录法以为模板，在反转录酶的作用下人工合成基因表达载体的构建基因表达载体的组成及作用基因表达载体的构建过程将目的基因导入受体细胞生物种类植物动物微生物常用方法受体细胞转化过程农杆菌转化法显微注射技术感受态细胞法体细胞受精卵原核细胞将目的基因插入到质粒的上转入农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的染色体上表达将含有目的基因的表达载体提纯取卵受精卵显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物处理细胞感受态细胞重组表达载体分子与感受态细胞混合感受态细胞吸收分子目的基因的检测与鉴定基因工程操作过程中的几个易错点目的基因的插入位点不是随意的基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。基因工程操作过程中只有第三步将目的基因导入受体细胞没有碱基互补配对现象第步存在逆转录法获得，第二步存在黏性末端连接现象，第四步存在检测分子水平杂交。农杆菌转化法原理农杆菌易感染植物细胞，并将其质粒上的转移并整合到受体细胞染色体上。目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。标记基因的种类和作用标记基因的作用筛选检测目的基因是否导入受体细胞，常见的有抗生素抗性基因发光基因表达产物为带颜色的物质等。受体细胞的选择受体细胞常用植物受精卵或体细胞经组织培养动物受精卵般不用体细胞微生物大肠杆菌酵母菌等。要合成糖蛋白有生物活性的胰岛素则必须用真核生物酵母菌需内质网高尔基体的加工分泌般不用支原体，原因是它营寄生生活定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是它无细胞核，也没有核糖体等细胞器，不能合成蛋白质。还应注意的问题有基因表达载体中，启动子片段起始密码子终止子片段终止密码子。基因表达载体的构建是最核心最关键的步，在体外进行。高考四川卷分将苏云金杆菌蛋白的基因导入棉花细胞中，可获得抗棉铃虫的转基因棉，其过程如下图所示注农杆菌中质粒上只有片段能转移到植物细胞中。过程需用同种酶对含基因的和质粒进行酶切。为将过程获得的含重组质粒的农杆菌筛选出来，应使用培养基。过程中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让进入棉花细胞除尽农杆菌后，还须转接到含卡那霉素的培养基上继续培养，目的是。限制性核酸内切选择筛选获得片段的植物细胞若过程仅获得大量的根，则应在培养基中增加以获得芽部分接种在无激素培养基上的芽也能长根，原因是。检验转基因棉的抗虫性状，常用方法是。种植转基因抗虫棉能减少的使用，以减轻环境污染。细胞分裂素浓度芽顶端合成的生长素向基部运输，促进根的分化投放棉铃虫农药解析切割目的基因和载体应使用同种限制性核酸内切酶,筛选细菌应使用选择培养基。农杆菌转化法的原理是农杆菌感染植物时，质粒上的片段能够转移并整合到植物细胞的染色体上。因为上具有卡那霉素抗性基因,所以可用含卡那霉素的培养基筛选出获得片段的植物细胞。植物组织培养过程中,可加入激素调节植物细胞的脱分化和再分化。生长素用量比细胞分裂素用量，比值高时,有利于根的分化抑制芽的形成比值低时,有利于芽的分化抑制根的形成。幼嫩的芽顶端可以产生生长素并向基部运输,促进根的分化，故芽在无激素的培养基中也可以生根。在个体水平上检测抗虫棉时可在抗虫棉上投放害虫来判断其是否具有抗虫的性状抗虫棉因具有抗虫性状，故可减少农药的使用，以减轻环境污染。高考山东卷改编，分人组织纤溶酶原激活物是种重要的药用蛋白，可在转基因母羊的羊乳中获得。流程如下基因与载体用切割后，通过连接酶连接，以构建重组表达载体。检测目的基因是否已插入受体细胞，可采用技术。将重组表达载体导入受精卵常用的方法是。为了获得母羊，移植前需对已成功转入目的基因的胚胎进行。利用胚胎分割和胚胎移植技术可获得多个转基因个体，这体现了早期胚胎细胞的。若在转基因母羊的羊乳中检测到,说明目的基因成功表达。同种限制性核酸内切酶或同种限制酶分子杂交或核酸探针显微注射法性别鉴定全能性或人组织纤溶酶原激活物解析用同种限制性核酸内切酶对目的基因和载体进行切割,以形成相同的黏性末端。检测目的基因是否已插入受体细胞，常用分子杂交技术。将重组表达载体导入受精卵动物细胞常用的方法是显微注射法。为了获得母羊,需要对胚胎进行性别鉴定。利用胚胎分割和胚胎移植技术可获得多个转基因个体，依据的原理是早期胚胎细胞的全能性。目的基因成功表达的标志是在转基因母羊的羊乳中检测到，即人组织纤溶酶原激活物。考点三蛋白质工程蛋白质工程与基因工程的比较区别项目蛋白质工程基因工程过程预期蛋白质功能设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列获取目的基因基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定项目蛋白质工程基因工程实质结果定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型和生物产品可生产自然界没有的蛋白质只能生产自然界已有的蛋白质联系蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。基因工程中所利用的些酶需要通过蛋白质工程进行修饰改造。高考全国卷Ⅱ分已知生物体内有种蛋白质，该蛋白质是种转运蛋白，由个氨基酸组成。如果将分子中位的丝氨酸变成亮氨酸，位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质不但保留的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的进行改造。氨基酸序列或结构其他合理答案也可以基因序列为基础，获得基因的途径有修饰基因或合成基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即。和或遗传物质蛋白质或转录逆转录翻