株，对孢子悬液进行紫外线和高能电子辐射复合处理，获得产酶能力提高的白 色孢子突变株。崔福绵等以亚硝基胍处理黑曲霉，获得高 产果胶酶突变株，此菌株在无锡酶制剂厂通过了中试，作为生产菌株进 行批量生产。据杜国军等报道，以黑曲霉为出发菌株， 进行紫外线诱变突变株，其产酶遗传特性稳定，果胶酶产量可达 干基以上，比出发菌株提高了倍。国外对果胶酶的研究较多，等人从 土壤中分离的产生的裂解酶的分子量为，酶活比同类报道提高 了。 目前国内工业上采用的果胶酶大多依赖进口产品，因此增加了生产成本，本 试验旨在筛选果胶酶的高产菌株，并对其发酵条件进行优化，为实现果胶酶的国 产化提供定的理论依据。刁望强应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件 材料与方法 材料 菌株由试验筛选得到。 果胶美国公司，马铃薯市售，硝酸铵，硫酸钠，硫酸镁，氯化 钾，硫酸铁，磷酸氢二钾，硝酸钠，牛肉膏，蛋白胨，琼脂，可溶性淀粉，硫代 硫酸钠，碘，碘化钾，可溶性淀粉，硫酸铵，蔗糖，葡萄糖等均为甘肃中瑞试 剂公司提供。 仪器设备 微量移液器，上海雷勃分析仪器有限公司，摇床，金 坛市恒丰仪器厂，高温灭菌锅型，上海绿宇精密仪器制造有限公司， 水浴锅型，上海申胜生物技术有限公司，电磁炉，烧杯，试管，培养 皿，接种针，酒精灯，碘量瓶，酸式滴定管等。 试验方法 发酵条件优化 酶活测定 参考孙越陈静,方法，进行酶活测定 酶液制备将发酵液于，离心后取上清液作为粗 酶液。 果胶溶液配制取果胶粉，加热溶解，煮沸，冷却后过滤，调节 值，定容至。 酶活测定取两个三角瓶，个为酶液瓶瓶，个为空白 瓶瓶，并分别在瓶瓶中各加入果胶溶液，瓶加重蒸馏 水和酶液后调值至，瓶加重蒸馏水，水浴后立即加 热煮沸并冷却。取上述瓶瓶中溶液各，分别加入另外两个三角瓶刁望强应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件 瓶中，各加浓度为的碳酸钠溶液摇匀，再各加浓度为 碘碘化钾溶液于两个三角瓶中，摇匀，加塞，放置后，分别吸取浓 度为硫酸加入上述两个三角瓶中，用硫代硫酸钠滴定至淡黄色 时停止滴定，加入浓度为的淀粉指示剂，此时溶液呈蓝色，继续滴定 至蓝色消失为止，分别记下消耗硫代硫酸钠的体积数。 结果计算将每小时酶促催化果胶分解成游离的半乳糖醛酸所需 的酶量定义为个酶活性单位，具体计算公式如下 活性单位数毫升酶液 式中空白消耗硫代硫酸钠溶液体积试样消耗硫代硫酸钠溶液体 积硫代硫酸钠摩尔浓度摩尔硫代硫酸钠相当于游离 半乳糖醛酸反应液体积吸取反应液体积反应时间 发酵培养基最佳配方及条件的选择 根据单因素试验结果，选择对果胶酶产酶水平影响显著的碳源，氮源 ，表面活性剂，发酵培养基初始和发酵温度五个因素进行二 次回归正交旋转组合设计试验，通过测定果胶酶活力，确定最佳的发酵培养基配 方。试验因子水平及编码见表。 表因素水平编码表 码值因素 数据分析 根据试验结果，采用建立五元二次回归方程以确定最佳试验条件 并对相关性强的两因素的交互作用进行响应面分析。 验证试验 根据试验得到的数据，进行产果胶酶菌株的发酵试验，以验证最佳生产工艺 条件。刁望强应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件 结果与讨论 产酶条件优化 利用二次回归正交旋转组合设计方案对菌株进行发酵条件的优化，其试验组 合及结果见表。 表五因素二次回归正交旋转组合实施试验结果表 刁望强应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件 五元二次回归方程的建立及检验 根据试验结果，采用计算各项回归系数，以建立菌株产酶酶活与 碳源，氮源，表面活性剂，发酵培养基初始和发酵温度 五因子的数学回归模型 式中为碳源氮源表面活性剂发酵培养基初始 值和发酵温度的编码值。由方差分析可知回归方程的失拟性检验 ，不显著，可以认为所选用的二次回归模型是适当的回 归方程的显著性检验，极显著，说明模型的预测值与 实际值吻合，模型成立对回归系数进行显著性检验，在显著水平剔除 不显著项,得到优化后的方程为 试验因子间交互作用分析 由回归系数的显著性检验可知，碳源与发酵培养基初始碳源 与温度表面活性剂与温度的互作效应对菌株的产酶效果影响显 著，对其分别作图，可直观地分析各因子间的互作效应。 由图可以看出，碳源和温度对产酶的影响较大。当碳源浓度处于低水平时， 随着的升高，菌株产酶性能逐渐提高当碳源浓度处于高水平时，随着 的升高，菌株产酶性能逐渐降低。当值较低时，随着碳源浓度的升高菌株产 酶性能逐渐升高当值较高时，随着碳源浓度的增加，菌株产酶性能急剧降 低。这可能是由于在低条件下，碳源可以逐渐水解成微生物容易利用的小分 子营养物质另外，由于菌株产生的酶为酸性水解酶，过高会影响酶的活性， 造成菌株产酶性能降低。刁望强应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件 图碳源和发酵培养基初始值对产酶的交互作用分析 由图可以看出，当碳源浓度处于较低水平时，随着发酵温度的升高，菌株 的产酶性能先急剧上升，随后缓慢下降当碳源浓度处于较高水平时，随着发酵 温度的升高，菌株的产酶性能先缓慢上升，再急剧下降。当温度较低时，随着碳 源浓度的提高，菌株的产酶性能逐渐升高当温度较高时，随着碳源浓度的增加， 菌株的产酶性能迅速降低。 图碳源和发酵温度对产酶的交互作用分析 由图可以看出，当表面活性剂浓度处于零水平附近时，温度对菌株产酶性 能影响微弱。当表面活性剂处于较低水平时，随着温度的升高，菌株的产酶性能 急剧升高，当表面活性剂浓度处于较高水平时，随着温度的升高，菌株的产酶性 能急剧下降。这可能因为低浓度的表面活性剂可促进胞内酶的外渗，从而使菌株 的产酶性能提高。 刁望强应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件 图表面活性剂和温度对产酶的交互作用分析 发酵条件的优化及验证 采用对方程进行求解，得出极大值点及极大值。试验结果如下 发酵碳源浓度发酵氮源浓度表面活性剂浓度发酵初始 发酵温度，在此条件下菌株理论产酶活性可以达到。 通过验证试验得到菌株实际产酶性能为，两者相差不大。 结论 菌株产酶性能优化条件的数学回归模型为 此模型能在试验范围内准确测得微生物产酶性能的条件。 通过因素之间的交互作用分析可以得出碳源与发酵培养基初始， 碳源与温度，表面活性剂与温度的互作效应对菌株的产酶效 果影响显著。 菌株发酵最优条件为发酵碳源浓度发酵氮源浓度表面活性 剂浓度发酵初始发酵温度，在此条件下菌株理论产酶活 性可以达到。通过验证试验得到菌株的实际产酶性能为， 两者相差不大。 刁望强应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件 参考文献 王璋食品酶学北京轻工业出版社 罗仓学,张长青果胶酶制剂对草莓汁澄清作用的研究青海大学学报自然科 学版 全桂静果胶酶高产霉菌的筛选及固体发酵条件的优化沈阳化工学院学 报 邱雁临,王金华果胶酶对山楂酒澄清的研究湖北农业科学 杨军,梅艳黑曲霉果胶酶在苹果汁澄清中的应用研究湖北农业科 学 赵丽莉微生物果胶酶研究及其在果蔬加工中的应用进展, 张树政酶制剂工业下册北京科学出版社 尤华,陆兆新,冯红霞微生物原果胶酶的研究进展工业微生物 杨天波微生物学通报 崔福绵果胶酶菌株的选育及其液体发酵条件的研究微生物学 报 杜国军产果胶酶黑曲霉的筛选及诱变育种农业与技术 孙越果胶酶活性的测定方法食品科技, 陈静,王淑军,杨从发,等果胶酶产生菌的选育淮海工学院学报, 本科毕业论文 论文题目应用二次回归正交旋转组合设计优化 果胶酶发酵条件 学院食品科学与工程学院 专业食品科学与工程 毕业届别届 姓名刁望强 指导教师韩舜愈 职称教授 甘肃农业大学教务处制 二〇〇九年六月 刁望强应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件 目录 前言 材料与方法 材料 仪器设备 试验方法 发酵条件优化 验证试验 结果与讨论 产酶条件优化 五元二次回归方程的建立及检验 试验因子间交互作用分析 发酵条件的优化及验证 结论 参考文献 , 致谢 刁望强应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件 应用二次回归正交旋转组合设计优化果胶酶发酵条件 刁望强 甘肃农业大学食品科学与工程学院级食科班 摘要本试验通过五元二次回归正交旋转组合设计对果胶酶的发酵条件进行了优化， 并建立了其产酶性能优化条件的数学回归模型。试验结果表明碳源与发酵培养基初 始，碳源与温度，表面活性剂与温度的互作效应对菌株产酶效果影响显著。菌株 的最适发酵碳源浓度发酵氮源浓度表面活性剂浓度发酵初 始发酵温度，在此条件下菌株产酶活性可以达到。 关键词果胶酶正交旋转组合发酵条件优化 前言 果胶质是植物产生的结构性多糖，广泛存在于高等植物的组 织中，尤其是水果和蔬菜组织的细胞间质和细胞初生壁中。果胶质属异多糖 ，分子量在，主要由半乳糖醛酸 经,糖苷键连接成直链状聚合物，部分半乳糖醛酸 上的羧基可与甲醇酯化形成甲酯。果胶即为甲酯化的多聚半乳糖醛酸物 质，其分子中约羧基是被甲酯化的。果胶按其分子中 半乳糖醛酸上羧基的酯化程度不同，可分为低甲酯果胶酯化度和高 甲酯果胶酯化度。 果胶酶是指能分解果胶质的多种酶的总称，不同来源的果胶酶 其特点也不同，微生物来源的果胶酶主要有聚半乳糖醛酸酶，聚半乳糖醛酸 裂解酶聚甲基半乳糖醛酸裂解酶和果胶酯酶。在果胶 酶系中发现较早，它可以水解半乳糖醛酸,糖苷键，产物为单半乳糖醛酸和 二半乳糖醛酸通过切断果胶分子,糖苷键，生成具有不饱和键的半乳糖 醛酸酯可以切断果胶分子,糖苷键，产物为个糖醛酸单位