实验参照前人在扇贝担轮幼虫中的研究报道，摸索出了适用于海胆稚胆阶段的裂解方法，并将裂解液直接用于扩增模板，进行了微卫星标记的扩增分析，得到了清晰的微卫星扩增带谱。

微卫星扩增结果说明该方法可以得到较好的幼虫模板，可以用于后续的分子标记分析。

该方法不需抽提可直接用于扩增，不但防止了抽提步骤引起的损失，而且简化了实验过程。

另外，该方法不但可以将微小的幼虫阶段纳入到分子标记的研究中来，便于更全面的掌握海胆整个生命周期内的遗传结构变化动态，扩大了海胆遗传育种学的研究范围和研究内容，也为海胆标记辅助育种等遗传学研究工作提供了早期取样研究的实例，大大简化该方向的研究步骤，且节约了人力物力及宝贵的时间。

亲本数目对海洋生物遗传结构的影响杂合度作为反映群体遗传变异的重要参数，其大小可反映群体遗传变异程度的高低。

通常，杂合度高的生物群体更容易适应环境变化，忍灌胶胶配置好后，后立即灌胶，室温凝胶小时以上，胶厚约为。

电泳组装电泳槽，放入缓冲液，于预电泳分钟，将产物与上样缓冲液混合，每个点样孔点样，电泳过硫酸铵过硫酸铵固体溶解于超纯水中，避光保存。

④，四甲基乙二胺，避光保存。

胶制备丙烯酰胺超纯水过硫酸铵固体，甲叉双丙烯酰胺加入超纯水，水浴搅拌溶解备用。

超纯水定容至反应条件预变性，分钟变性，秒退火退火温度秒④延伸，分钟循环从到共个循环下最后延伸分钟保存。

扩增产物的电泳分离制胶丙烯酰胺贮备液丙烯酰胺体系需加体积海胆幼虫裂解液引物大连海洋大学本科毕业论文材料与方法冰箱中保存。

扩增以稚胆的裂解液为模板，进行扩增，反应体系见表。

表中间球海胆微卫星扩增反应体系反应壳上剪个小口，然后加入裂解液，。

加入蛋白酶恒温裂解后，升温到保持以灭活蛋白酶。

裂解液放入，和家系分别取样只和只，用酒精固定，小时后换次固定液即可，冰箱中保存，准备进行分子标记分析。

实验方法提取将每只海胆分离开来，蒸馏水反复冲洗，分别放入离心管中。

灭菌后的小剪刀在海胆的分子遗传学研究内容。

大连海洋大学本科毕业论文材料与方法第二章材料和方法实验材料于年月，分别由只海胆雌雄和只海胆雌雄建立中间球海胆混交家系，分别命名为和。

受精后个月，在中间球海胆的稚海胆时期和个极显著相关标记数分别为和个。

本研究采用微卫星标记技术，分析了由不同数目亲本所产生的两个中间球海胆群体的遗传结构，建立了稚胆材料的固定裂解及技术，丰富了中间球海胆海胆壳径体质量和生殖腺质量等主要经济性状相关的分子标记进行筛选，并对这些数量性状与分子标记的相关性进行分析。

结果表明，对引物共筛选出与壳径体质量生殖腺质量显著相关标记数分别为体遗传结构的微卫星分析，利用对微卫星分子标记对中间球海胆的个野生和个养殖群体进行了遗传多样性分析。

邹林林等利用技术，对以光棘球海胆♀中间球海胆♂的代为材料，对与传距离和遗传相似性等遗传参数，研究个虾夷马粪海胆群群体间的差异，发现山东荣成群体与大连个群体间差异较大，群体间存在定程度的分化，将有可能逐渐形成新的地理种群。

耿慧君等进行了中间球海胆野生和养殖群行了分析。

丁君等采用磁珠富集法获得了虾夷马粪海胆的微卫星序列，利用软件设计引物，经筛选，应用其中的对微卫星引物获得了个虾夷马粪海胆养殖群体的等位基因频率等位基因数杂合度及遗标记技术在海胆研究上的应用的相关报道相比较少。

等利用个微卫星标记分析了从大西洋北部至太平洋东北部个取样地点的绿海胆的遗传结构。

常亚青等曾利用技术对种经济海胆基因组多态性进胆与仿刺参投饵混养的试验，发现在静水精养下混养时海胆的特定生长率和成活率比单养高，水质稳定，适宜密度为每立方米。

目前国内外对海胆形态学生物化学以及遗传学的研究都有报道，但有关分子同海胆达到同步繁殖，在下各种海胆杂交组合的受精率与亲本亲缘关系有关，同时受到双亲繁殖适宜温度的影响，受大连水产学院本科毕业论文前言精率介于之间。

王吉桥等于年月曾进行了不同密度虾夷马粪海胆同海胆达到同步繁殖，在下各种海胆杂交组合的受精率与亲本亲缘关系有关，同时受到双亲繁殖适宜温度的影响，受大连水产学院本科毕业论文前言精率介于之间。

王吉桥等于年月曾进行了不同密度虾夷马粪海胆与仿刺参投饵混养的试验，发现在静水精养下混养时海胆的特定生长率和成活率比单养高，水质稳定，适宜密度为每立方米。

目前国内外对海胆形态学生物化学以及遗传学的研究都有报道，但有关分子标记技术在海胆研究上的应用的相关报道相比较少。

等利用个微卫星标记分析了从大西洋北部至太平洋东北部个取样地点的绿海胆的遗传结构。

常亚青等曾利用技术对种经济海胆基因组多态性进行了分析。

丁君等采用磁珠富集法获得了虾夷马粪海胆的微卫星序列，利用软件设计引物，经筛选，应用其中的对微卫星引物获得了个虾夷马粪海胆养殖群体的等位基因频率等位基因数杂合度及遗传距离和遗传相似性等遗传参数，研究个虾夷马粪海胆群群体间的差异，发现山东荣成群体与大连个群体间差异较大，群体间存在定程度的分化，将有可能逐渐形成新的地理种群。

耿慧君等进行了中间球海胆野生和养殖群体遗传结构的微卫星分析，利用对微卫星分子标记对中间球海胆的个野生和个养殖群体进行了遗传多样性分析。

邹林林等利用技术，对以光棘球海胆♀中间球海胆♂的代为材料，对与海胆壳径体质量和生殖腺质量等主要经济性状相关的分子标记进行筛选，并对这些数量性状与分子标记的相关性进行分析。

结果表明，对引物共筛选出与壳径体质量生殖腺质量显著相关标记数分别为和个极显著相关标记数分别为和个。

本研究采用微卫星标记技术，分析了由不同数目亲本所产生的两个中间球海胆群体的遗传结构，建立了稚胆材料的固定裂解及技术，丰富了中间球海胆分子遗传学研究内容。

大连海洋大学本科毕业论文材料与方法第二章材料和方法实验材料于年月，分别由只海胆雌雄和只海胆雌雄建立中间球海胆混交家系，分别命名为和。

受精后个月，在中间球海胆的稚海胆时期，和家系分别取样只和只，用酒精固定，小时后换次固定液即可，冰箱中保存，准备进行分子标记分析。

实验方法提取将每只海胆分离开来，蒸馏水反复冲洗，分别放入离心管中。

灭菌后的小剪刀在海胆的壳上剪个小口，然后加入裂解液，。

加入蛋白酶恒温裂解后，升温到保持以灭活蛋白酶。

裂解液放入冰箱中保存。

扩增以稚胆的裂解液为模板，进行扩增，反应体系见表。

表中间球海胆微卫星扩增反应体系反应体系需加体积海胆幼虫裂解液引物大连海洋大学本科毕业论文材料与方法反应条件预变性，分钟变性，秒退火退火温度秒④延伸，分钟循环从到共个循环下最后延伸分钟保存。

扩增产物的电泳分离制胶丙烯酰胺贮备液丙烯酰胺固体，甲叉双丙烯酰胺加入超纯水，水浴搅拌溶解备用。

超纯水定容至过硫酸铵过硫酸铵固体溶解于超纯水中，避光保存。

④，四甲基乙二胺，避光保存。

胶制备丙烯酰胺超纯水过硫酸铵灌胶胶配置好后，后立即灌胶，室温凝胶小时以上，胶厚约为。

电泳组装电泳槽，放入缓冲液，于预电泳分钟，将产物与上样缓冲液混合，每个点样孔点样，电泳小时。

染色和显色电泳结束后，将胶取下，用纯水冲洗次，染液溶于超纯水中染色分钟。

再将胶用纯水冲洗次。

配置显色液无水溶于超纯水中，加入大连海洋大学本科毕业论文材料与方法甲醛，将胶在显色液中显色到适合程度为止。

④用纯水冲洗，停止染色。

数据统计与分析微卫星产物电泳结果经肉眼观察，将每个微卫星位点的等位基因依据片断大小分别命名为按照共显性标记进行基因型统计，带型不清晰或多次扩增未见产物的个体用表示。

结果输入软件，进行分析。

根据法分别求算大小两个海胆群体的基因多样性指数，。

其中为第个位点上的等位基因数，为检测到的位点数。

为种群内总的基因多样性，计算公式为为位点总数，和分别为总的种群中位点上的显性频率和隐性频率。

为种群内的基因多样性。

指数的计算公式为，其中为产物条带的表型。

大连海洋大学本科毕业论文讨论第三章实验结果微卫星扩增位点分析本实验在等开发的中间球海胆微卫星引物中，挑选多态性较好扩增带型清晰的对引物，用于中间球海胆稚胆的微卫星扩增及群体遗传多平均观测等位基因数平均有效等位基因数平均香浓氏指数实际杂合度期望杂合度奈氏杂合度大连海洋大学本科毕业论文讨论第四章讨论海胆稚胆提取及扩增般来说，海洋生物提取方法多为肌肉组织酚氯仿抽提法，这种方法需要反复抽提以去除蛋白质，保证的纯度和质量。

该过程较繁琐，且经反复抽提，损失量很大。

对于成体来说，往往组织量较大，因此可以在定程度上弥补在抽提过程中的丢失。

而对于海洋生物发育早期来说，大多个体组织较小，需要显微观察才能分辨其形态结构，如果采用传统的酚氯仿抽提法，由于大量的损失很难获得足够量的用于后续分子生物学研究。

本实验参照前人在扇贝担轮幼虫中的研究报道，摸索出了适用于海胆稚胆阶段的裂解方法，并将裂解液直接用于扩增模板，进行了微卫星标记的扩增分析，得到了清晰的微卫星扩增带谱。

微卫星扩增结果说明该方法可以得到较好的幼虫模板，可以用于后续的分子标记分析。

该方法不需抽提可直接用于扩增，不但防止了抽提步骤引起的损失，而且简化了实验过程。

另外，该方法不但可以将微小的幼虫阶段纳入到分子标记的研究中来，便于更全面的掌握海胆整个生命周期内的遗传结构变化动态，扩大了海胆遗传育种学的研究范围和研究内容，也为海胆标记辅助育种等遗传学研究工作提供了早期取样研究的实例，大大简化该方向的研究步骤，且节约了人力物力及宝贵的时间。

亲本数目对海洋生物遗传结构的影响杂合度作为反映群体遗传变异的重要参数，其大小可反映群体遗传变异程度的高低。

通常，杂合度高的生物群体更容易适应环境变化，忍受自然选择压力并可能具有更多的优良经济性状。

般认为，用于检测遗传变化的标记在群体中的平均杂合度的范围应该在之间才有实际意义。

战爱斌等检测了仿刺参个微卫星位点的平