璃板晾干或电吹风机吹干，并安装好。配制分离胶，将分离胶用移液器小心灌入两玻璃板之间要求无气泡，至距玻璃板上端约梳子的齿长加上止，并在胶液面上加约高乙醇溶液密封，以防空气进入。将待测蛋白样品体积的蛋白上样缓冲液加入待测蛋白样品中，充分混均，加热使蛋白变性，然后置低速离心机内离心约，取出静置冰上备用。待分离胶完全凝固后分离胶与乙醇封闭液分界清楚时，约，倒出上层乙醇封闭液，再用预先准备好的滤纸条小心吸干残余的乙醇封闭液，然后在万方数据三峡大学硕士学位论文管中配制浓缩胶，混合均匀后用移液器迅速注入分离胶之上，到平玻璃板上端为止，随后小心插入准备好的梳子胶中不能留有气泡。当浓缩胶在玻璃板间完全凝固后，小心向上取出梳子，再向电泳槽中倒入电泳缓冲液至淹没玻璃板上端约，随后在每个上样孔中分别加入已经制备好的混有蛋白上样缓冲液的待检测的蛋白样品溶液，以及溶液。接通电源，浓缩胶，约样品条带到两种胶分界处止，分离胶电泳约，当溴酚蓝指示带刚跑至分离胶底部和或已充分展开即可终止电讨论小结参考文献峡大学硕士学位论文目录英文缩略词表引言材料与方法结果ⅣⅣⅣ万方数据三万方数据三峡大学硕士学位论文,万方数据三峡大学硕士学位论文ⅣⅣⅣ万方数据三峡大学硕士学位论文目录英文缩略词表引言材料与方法结果讨论小结参考文献综述后记附录攻读硕士学位期间已发表和录用的学术论著附录三峡大学动物实验伦理审查表Ⅴ万方数据三峡大学硕士学位论文英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称平滑肌肌动蛋白胶原容积积分天细胞外基质上皮间充质转化氯化钠溶液小牛血清白蛋白将各种试剂充分混匀后，室温静置，在分光光度计上比色分析。根据标准蛋白的含量以及其吸光度的关系，制作标准曲线。检测待测样本蛋白含量根据待测标本的数量，取若干个新的管，向每个管中加入考马斯亮蓝溶液，然后在室温下静置，再用于检测蛋白。任取支装有考马斯亮蓝溶液的管，向其中加入氯化钠溶液，将两者充分混合均匀，并静置后用于空白对照。再另取支装有考马斯亮蓝溶液的管，向其中加入氯化钠溶液以及待检测蛋白样品，将三者充分混合均匀后静置，然后在分光光度计上检测分析。根据每个待测标本的吸光度，分别在所制作的的标准曲线上计算出待检测样本中蛋白的含量。注，也可以在微量核酸蛋白检测仪中直接测定待测样品蛋白浓度，每各样品测三次，取平均值即可。分离蛋白样品，采用凝胶电泳法清洁玻璃板制胶支架电泳槽以及梳子等配件先用环保洗手液清洗，再用双蒸水冲洗至少遍，其中玻璃板要求不挂水，玻璃板晾干或电吹风机吹干，并安装好。配制分离胶，将分离胶用移液器小心灌入两玻璃板之间要求无气泡，至距玻璃板上端约梳子的齿长加上止，并在胶液面上加约高乙醇溶液密封，以防空气进入。将待测蛋白样品体积的蛋白上样缓冲液加入待测蛋白样品中，充分混均，加热使蛋白变性，然后置低速离心机内离心约，取出静置冰上备用。待分离胶完全凝固后分离胶与乙醇封闭液分界清楚时，约，倒出上层乙醇封闭液，再用预先准备好的滤纸条小心吸干残余的乙醇封闭液，然后在万方数据三峡大学硕士学位论文管中配制浓缩胶，混合均匀后用移液器迅速注入分离胶之上，到平玻璃板上端为止，随后小心插入准备好的梳子胶中不能留有气泡。当浓缩胶在玻璃板间完全凝固后，小心向上取出梳子，再向电泳槽中倒入电泳缓冲液至淹没玻璃板上端约，随后在每个上样孔中分别加入已经制备好的混有蛋白上样缓冲液的待检测的蛋白样品溶液，以及溶液。接通电源，浓缩胶，约样品条带到两种胶分界处止，分离胶电泳约，当溴酚蓝指示带刚跑至分离胶底部和或已充分展开即可终止电泳。转膜切取包含待测蛋白样品区域的胶块，取与胶等大的张膜和张滤纸，并将膜完全浸泡在分析纯甲醇中大于。将浸泡过甲醇的膜个海绵垫以及张滤纸完全浸泡在转移缓冲液中至少，随后在转移缓冲液中从黑色夹片负极开始，依次放置海绵垫层滤纸凝胶膜层滤纸海绵垫红色夹片正极，各层均须叠放整齐，且整个操作过程中各层之间不能留有气泡，在电转移槽中安好夹子后置于大方盒内，然后向电转移槽内注入足量转移缓冲液，电转移槽外加足够多的冰粒，接通电源，转移。封闭用镊子取出膜，将膜正面朝上，切右上角标记浸入盛有稀释的脱脂牛奶封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭。抗体孵育抗孵育另取个干净平皿，按的比例，在平皿中加入抗标记兔抗鼠抗体和稀释的脱脂牛奶适量，混匀，将膜浸入其中，在条件下，摇床上孵育过夜，然后在脱色摇床上用泡洗次，每次至少。二抗孵育按准备稀释的二抗标记山羊抗兔于培养皿中，将上步洗过的膜浸入其中，室温下孵育，然后用在脱色摇床上泡洗次，每次大于。显色在暗室中，取等体积的液液在离心管中混匀，将膜蛋白面朝上与此混合液充分接触般可看到荧光。将膜取出，用滤纸吸尽残液，用保鲜膜把膜包起来。将封好的膜放入暗匣中，把光片覆盖在膜的上面，根据荧光的强弱曝光。万方数据三峡大学硕士学位论文取出胶片，浸入显影液中约，直至条带的显现。将该胶片稍水洗后浸入定影液中，待胶片透明后取出，流水冲洗胶片，清除定影液，室温下晾干。拍照，结果采用尼康图像分析系统分析条带光密度值。实时荧光定量引物信息先参照基因库基因序列设计和引物，后发送至上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物上游序列下游序列产物长度退火温度总提取为减少的降解，所需各种规格枪头和管，均须采用水浸泡过夜，以去除酶，蒸汽高压后，置洁净烤箱内烤干备用。实验时戴好口罩手套。肺组织总提取用左右的充分洗涤肺组织块次，尽量不留血污，然后用滤纸拭干，称取肺组织块置于预冷的匀浆器中，先用眼科剪剪成细小的组织粒，然后加入肺组织倍体积的约，在冰上反复研磨肺组织粒，使其彻底匀浆。用移液器将肺组织匀浆转移到新的管，室温下静置，使肺组织充分裂解。加入分析纯氯仿，剧烈颠倒混匀约，冰上静置约分层即可，然后离心,。小心吸取上清于新的管水处理过的中，约，不可吸取蛋白层，等体积加入异丙醇，轻轻颠倒混匀后冰上静置，然后离心，。弃上清用移液枪小心尽量吸尽，各管加冰预冷的乙醇水配制，然后离心,。弃上清用移液枪小心尽量吸尽，置于冰上不盖，适度凉干约，然后各管加入水溶解，保存。分析万方数据三峡大学硕士学位论文取样品，加入和，用枪头吹打混匀，行琼脂糖凝胶含电泳检测的质量，紫外光照胶后查看条带明暗程度，以最亮为佳。紫外分光光度法检测的浓度和纯度用水对仪器进行校对清零，分别检测和波长下样品的值，按公式计算其浓度和纯度浓度，纯度，比值介于和之间说明纯度较高。逆转录将各管样品浓度定量为。向各管中加入，再根据各管样品浓度加入适量超纯水，使总反应体积保持为，涡旋混匀，转瞬离心数秒后将样品置于仪中，设置程序温度为。程序暂停后，在冰上，将根据样品数量按比例预先配置好的混合溶液，按每管加入，使总反应体积保持。涡旋混匀，转瞬离心数秒后将样品置于仪中，设置程序为终止反应，收集各管产物，保存备用。实时荧光定量每孔加入上下游引物各稀释倍和双蒸水，使总反应体积保持。每实验重复次，每个样品重复孔，取平均值设置程序预变性变性退火转到，共个，从至间采集溶解曲线。计算值值对照组基因值基因值值实验组基因值基因值值值干预组值实验组根据值，计算对照组与实验组