万方数据万方数据中文摘要是种在真核生物中高度保守小分子蛋白，属于小蛋白家族。蛋白与不同调节因子和辅助因子相互作用，参与核膜重建纺锤体组装复制细胞周期调节和核质间物质运输等。蛋白在其辅助蛋白调控下进行和两种结合态之间不断循环转变，表现出功能多样性。染色体浓缩调节因子是唯已知鸟嘌呤核苷酸交换因子，含有保守结构域，与蛋白结合，促进转变为结合态，从而促进核质运输，同时在染色体端粒沉默细胞周期调控和微管组装发挥重要功能。嗜热四膜虫是种营自由生活淡水单细胞原生生物，具有核二态性，即含有多倍体体细胞大核和二倍体生殖小核。生殖方式主要有无性生殖和有性生殖两种方式。无性生殖时期，大核无丝分裂而小核进行有丝分裂有性生殖时期，小核进行减数分裂和有丝分裂后进行核交换进而形成合子核，产生新大核和小核而旧大核降解。嗜热四膜虫细胞中核结构精细动态变化使其成为研究细胞核结构和发育良好模式生物。本课题组先前研究表明嗜热四膜虫中和蛋白调控了大核无丝分裂，它们异常表达会使细胞增殖速度变慢，但至今还没有发现关于嗜热四膜虫中蛋白相关研究。本研究首次从嗜热四膜虫大核基因组中鉴定出个新基因，并在生物信息学水平和细胞分子水平进行了分析，研究结果如下生物信息学分析通过同源序列比对，我们从四膜虫基因组数据库鉴定了人同源物基因，该基因全长，开放阅读框，预测编码个氨基酸。对其氨基酸序列分析发现含有个结构域，将其编码基因命名为四膜虫。检测转录水平，发现在嗜热四膜虫不同细胞周期中都有表达，并在有性生殖时期表达水平达到最高。本研究结果与四膜虫功能基因组数据库中该基因表达谱相致，进步证实了在四膜虫发育过程中动态表达。聚类分析表明分子进化和物种进化相致，表明了在生物进化过程中，蛋白具有保守功能。万方数据细胞定位构建含有标签重组质粒，将转入野生型和四膜虫细胞中，通过同源重组基因替代基因，在诱导下受到基因启动子调控，梯度增加巴龙霉素浓度筛选突变体细胞株，通过鉴定获得整合基因突变体细胞株。单克隆抗体免疫荧光定位分析表明，在营养生长期，特异地定位于大核和小核，饥饿时期同样定位于大核和小核中，在有性生殖时期，亲本大核和小核仍有定位。此外还定位于降解旧大核上，直到亲本大核完全降解，表明是细胞核特异功能因子。过表达影响细胞核分裂在启动子调控下基因，通过不同浓度诱导，实现基因过表达。通过染料对过表达细胞株中细胞核进行染色，观察细胞核分裂过程。分析过表达对细胞发育影响，结果显示过量表达导致细胞中大核无丝分裂异常，进而抑制了大核无丝分裂，最终产生部分无大核异常细胞。敲减引起小核异常分裂为了进步分析功能，构建了基因敲除质粒，转化野生型四膜虫细胞，通过巴龙霉素浓度梯度筛选，细胞表型分配获得基因敲减突变体细胞株。结果表明基因对后代发育是必须。进步分析敲减对细胞发育影响，染色敲减细胞株，观察细胞核分裂过程，发现发育细胞中产生多个小核，大核无丝分裂受到抑制，而且抑制了细胞增殖速率。总之，本研究首次从嗜热四膜虫中鉴定出个新基因，异常表达影响了细胞正常核分裂，这种异常表型与突变体锁定态和锁定态异常表达表型是样，暗示可能通过改变浓度梯度，进而影响细胞核发育。正常表达对嗜热四膜虫细胞增殖过程起到重要调控作用。关键词染色体浓缩调节因子嗜热四膜虫细胞定位核分裂万方数据,万方数据嗜热四膜虫中染色体浓缩调节因子鉴定及功能分析总结与展望总结本研究首次从嗜热四膜虫大核基因组中鉴定出个新基因，并在生物信息学水平和细胞分子水平进行了分析，主要研究结果如下通过序列比对分析和生物信息学分析，发现嗜热四膜虫中基因识别号为编码基因与人和酵母基因同源性最高，并将其编码基因命名为基因，基因全长，开放阅读框为，预测编码个氨基酸。检测基因表达谱，分析表明在嗜热四膜虫营养生长饥饿和有性生殖过程中，基因都有表达，并且在接合生殖过程中转录水平达到最高进化分析和聚类分析表明四膜虫中在进化中是保守，并在特定物种间分化。含有端融合血球凝集素标签载体，对嗜热四膜虫中蛋白定位模式进行免疫荧光定位分析营养生长时期，特异定位于大核和小核中饥饿时期，定位模式没有改变，仍特异定位于大核和小核中在接合生殖时期，亲本大核和小核中有较强荧光信号，并且随着小核进行减数分裂，聚集在延伸染色质上，并且也定位于新形成大核上，在降解大核上也有很强荧光信号。嗜热四膜虫中蛋白过量表达之后，在不同浓度诱导下使得过量表达。过表达之后抑制了大核无丝分裂，并且使细胞增殖速率下降，产生了没有大核异常后代细胞，过表达之后影响嗜热四膜虫大核无丝分裂，并产生异常子代细胞。嗜热四膜虫中基因通过重组载体被敲减之后，基因部分被基因盒所替代，得到了敲减基因突变体细胞株，敲减之后抑制了大核无丝分裂，导致多小核产生，并细胞株生长速率下降，产生了多小核后代细胞。本研究首次鉴定了嗜热四膜虫中基因，异常表达影响了细胞核分裂，抑制了细胞核分裂，产生核发育异常后代细胞，这种异常表型与蛋白和蛋白异常表达之后表型是致，表明通过改变正常浓度梯度，进而影响细胞核分裂和细胞增殖速度。因此参与了信号通路对嗜热四膜虫细胞核分裂和细胞增殖等过程。正常表达对万方数据总结与展望嗜热四膜虫中细胞核分裂核发育以及细胞增殖过程起到重要调控作用。展望在本研究基础上，拟在以下几个方面开展进步工作嗜热四膜虫中其他基因功能进步研究，探究参与信号通路中是否有其他基因也参与调控了细胞核发育核分裂以及细胞增殖过程。在细胞中定位模式发现在有性生殖时期定位于降解亲本大核，进步探究结合蛋白以及有关凋亡促进因子在嗜热四膜虫程序性核死亡过程中发挥功能实时荧光定量分析,和在信号通路中相互作用。万方数据攻读学位期间取得研究成果攻读学位期间取得研究成果攻读硕士学位期间发表论文学术论文段文靖，许静，王伟嗜热四膜虫染色体浓缩调节因子定位及功能中国生物化学与分子生物学报会议论文段文靖，陈波，王伟嗜热四膜虫染色体浓缩调节因子定位与功能分析中国动物学会原生动物学分会第十七次学术讨论会，年月，吉林长春二参与科研项目四膜虫有性生殖和无性生殖过程中定位和功能分析国家自然科学基金，年，四膜虫细胞定位及功能分析。教育部科学技术研究重点项目，编号三参加学术交流年月参加“中国动物学会原生动物学分会第十七次学术讨论会”吉林长春万方数据致谢致谢三年硕士生活即将画上圆满句号，想起三年前自己刚踏进这座拥有百年历史校园，我收获不只是知识，更多是做人道理。如今将要离去，心中充满了眷恋，向往着明天。回想起三年点点滴滴，历历在目。读研期间我得到了身边很多人帮助，在这里我要感谢大家。首先，要衷心感谢我导师王伟教授。本论文是在王伟老师悉心指导下完成。从论文选题文献收集实验设计结果讨论和最终论文定稿，从内容格式到标点符号，都给了我许多建设性意见。王老师不仅专业知识渊博，治学态度严谨，工作精益求精，诲人不倦高尚师德，严以律己宽以待人崇高风范，朴实无华平易近人人格魅力对我影响深远。不仅使我树立了远大学术目标掌握了基本研究方法，还使我明白了许多待人接物与为人处世道理。在此，谨向王老师表示崇高敬意和由衷感谢！其次，要感谢许静老师，她不仅为我实验提供思路，还关心我生活，在此我要衷心感谢许老师对我各方面帮助。还要感谢生物技术研究所所有教师，学者风范梁爱华老师风趣幽默柴宝峰老师温文尔雅付月君老师绅士风范申泉老师文思敏捷张志云老师兢兢业业李师傅，在此要特别感谢这些亲爱老师们在我生活和实验中对我真诚帮助和支持。再次，感谢实验室已经毕业成熟稳重梁海霞师姐活泼开朗张磊师兄伶牙俐齿赵丹师兄善解人意卢剑功师兄勇敢正义张鹏幸师姐心地善良卫银丹，还有现在实验室幽默机智周焕新师兄处事洒脱陈波师妹文艺范任晓琦师弟积极负责袁亚静师妹热心助人郭荣师妹聪明好学郭宏艳师妹正直热心乔菊霞师妹，还有课题组师兄弟姐妹们在实验中帮助和支持，感谢实验室与我朝夕相处大课题组每位成员。同时感谢生物技术研究所为我们提供研究条件和科研平台。最后我要感谢我家人。感谢我爸爸和妈妈，是他们三年来对我学习和生活无微不至关怀和鼓励，是他们给了我不断前行动力和依靠，是我温暖港湾。最后，再次真诚感谢所有帮助过关心过我老师家人朋友及同学。段文靖二零四年六月万方数据个人简况及联系方式个人简况及联系方式个人简况段文靖女年月生山西省大同市人晋中学院生命科学学院生命科学专业理学学士学位山西大学化学生物学与分子工程教育部重点实验室水生生物学专业理学硕士学位联系方式电子信箱万方数据嗜热四膜虫中染色体浓缩调节因子鉴定及功能分析作者段文靖学位授予单位山西大学引用本文格式段文靖嗜热四膜虫中染色体浓缩调节因子鉴定及功能分析学位论文硕士万方数据届硕士学位论文嗜热四膜虫中染色体浓缩调节因子鉴定及功能分析作者姓名段文靖指导教师王伟教授学科专业水生生物学研究方向细胞分子生物学培养单位生命科学学院学习年限年月至年月二〇四年六月万方数据山西大学届硕士学位论文嗜热四膜虫中染色体浓缩调节因子鉴定及功能分析作者姓名段文靖指导教师王伟教授学科专业水生生物学研究方向细胞分子生物学培养单位生命科学学院学习年限年月至年月二〇四年六月万方数据,万方数据承诺书承诺书本人郑重声明所呈交学位论文，是在导师指导下独立完成，学位论文知识产权属于山西大学。如果今后以其他单位名义发表与在读期间学位论文相关内容，将承担法律责任。除文中已经注明引用文献资料外，本学位论文不包括任何其他个人或集体已经发表或撰写过成果。作者签名年月日万方数据学位论文使用授权声明学位论文使用授权声明本人完全了解山西大学有关保留使用学位论文规定，即学校有权保留并向国家有关机关或机构送交论文复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印缩印或扫描等手段保存汇编学位论文。同意山西大学可以用不同方式在不同媒体上发表传播论文全部或部分内容。保密学位论文在解密后遵守此协议。作者签名导师签名年月日万方数据目录中文摘要第章文献综述蛋白概述蛋白蛋白活性调控及其辅助调控因子信号通路基本功能染色体浓缩调节因子结构域功能参与调控核质运输参与有丝分裂期纺锤体组装参与调控细胞周期和核膜重建防止多重复制动态与染色质结合调节纺锤体组装检验点调控核膜重建嗜热四膜虫概述本课题研究意义第二章嗜热四膜虫中基因生物信息学分析材料菌株与质粒主要试剂主要试剂配制主要实验仪器实验所用引物万方数据方法嗜热四膜虫细胞培养和饥饿嗜热四膜虫交配嗜热四膜虫提取嗜热四膜虫合成嗜热四膜虫基因实时荧光定量分析嗜热四膜虫基因克隆蛋白序列聚类分析及表达特性结果基因序列扩增基因表达谱分析蛋白序列分析和聚类分析讨论第三章嗜热四膜虫中细胞定位分析材料菌株和质粒试剂与工具酶实验所需引物主要实验仪器主要试剂配制方法四膜虫细胞培养过表达载体构建嗜热四膜虫重组载体构建嗜热四膜虫细胞基因枪转化阳性克隆筛选嗜热四膜虫快速提取和鉴定免疫荧光定位分析结果万方数据内源性表达融合载体构建及重组鉴定在四膜虫不同细胞周期中定位模式讨论第四章嗜热四膜虫中异常表达都导致异常细胞核分裂