分类号密级公开硕士学位论文转录因子相关功能蛋白的筛选学位申请人伍仙凤学科专业免疫学指导教师李书国副教授盛德乔教授二四年五月万方数据,万方数据三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名日期三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的切法津和经济后果。学位论文作者签名日期万方数据三峡大学硕士学位论文内容摘要目的获得转录因子稳定高表达的细胞株，通过免疫共沉淀和质谱分析技术筛选能与相互作用的蛋白质因子，以阐明在淋巴结中调控外周组织抗原基因表达的分子机制及外周免疫耐受建立维持的机制，为型糖尿病早期干预和治疗提供新策略。方法用转染试剂将质粒和分别转染和细胞株，经小时后，通过荧光显微镜观察在种细胞中的定位。用转染试剂将质粒分别转染和细胞株，同时设置相应未转染的空白对照组，经小时后，通过法和法检测在种细胞中表达水平，通过法检测在种细胞中蛋白表达水平。用转染试剂将质粒转染细胞，经小时后，用的筛选阳性克隆，挑取单个阳性克隆扩大培养，用免疫荧光和检测鉴定稳定表达的细胞株。抽提和正常细胞的核蛋白，用亲和珠子进行，分离，挑选明显富集和对照泳道没有的条带做质谱分析，明确的相关功能蛋白。结果荧光显微镜下可见定位于细胞核。检测转染组的表达水平明显高于未转染组，分别为.和.，差异具有统计学意义法检测转染组有融合蛋白表达。成功获得稳定高表达的细胞株。经筛选和质谱分析得到些的相关功能蛋白。结论成功获得稳定高表达的细胞株，经筛选和质谱分析获得了些相关的功能蛋白，为阐明调控外周组织抗原表达的分子机制及外周免疫耐受建立维持的机制奠定了重要的实验基础。关键词稳定表达免疫共沉淀质谱分析筛选万方数据三峡大学硕士学位论文,.,.,.,..,.万方数据三峡大学硕士学位论文.,.万方数据三峡大学硕士学位论文目录英文缩略词表引言材料与方法结果第部分真核表达载体和的酶切鉴定第二部分在细胞内定位和表达第三部分筛选及鉴定稳定高表达的细胞株第四部分免疫共沉淀获得的相关功能蛋白第五部分质谱分析的相关功能蛋白讨论小结参考文献综述后记万方数据三峡大学硕士学位论文英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称胎牛血清碱基对极限必需培养基过硫酸铵四甲基乙二胺二甲基亚砜溴化乙锭乙二铵四乙酸磷酸盐缓冲液十二烷基硫酸钠氨苄青霉素肉汤培养基光密度卡那青霉素聚合酶链式反应羟乙基哌嗪乙磺酸乙酸电泳缓冲液增强的化学发光万方数据三峡大学硕士学位论文引言型糖尿病，是由于自身免疫系统破坏了胰腺的胰岛细胞，导致机体内的胰岛素分泌绝对不足，患者需终生注射胰岛素制剂，是种对人类健康危害极大且目前尚无法治愈的疾病，因此，本课题组从发病机制的个方面为切入点，探索并明确与发病相关的基因，为后续的基因靶向干预和治疗奠定坚实的实验基础。现有的权威教材对于发病具体机制的描述仍不十分清楚，随着科研技术不断更新进步，越来越多的学者认为发病是多因素综合作用的结果，其中发病机制之是由于中枢和或外周免疫耐受被打破。中枢免疫耐受的作用是将进入胸腺的自身反应性淋巴细胞通过阴性选择而清除外周免疫耐受的作用是限制并抑制从胸腺逃逸出的成熟淋巴细胞的活性。此外，外周免疫耐受可通过克隆清除克隆无能免疫忽视调节性细胞，的免疫抑制耐受型树突状细胞,等多种机制维持。旦外周免疫耐受被打破，将引发自身免疫反应，导致严重的自身免疫性疾病，而即是其中之。有研究小组已证实，在外周淋巴器官中诱导外周免疫耐受是通过多种外周组织特异抗原的异位表达而实现的，即在小鼠胰淋巴结基质细胞中发现了系列外周组织抗原，基因的表达，还发现基因的表达受转录因子调控，在模型小鼠体内发现的功能异常，进步证明与密切相关。以上研究结果均提示在小鼠体内，转录因子对于外周免疫耐受的建立和维持具有至关重要的作用。最初来源于果蝇的核抽提物，在果蝇早期胚胎发育过程中具有重要作用，它是种由个氨基酸组成的核蛋白质，含有些十分重要的功能结构域，如图所示，其中结构域为结合结构域，能结合携带基序的序列，其功能与染色质依赖的转录调控有关结构域含有两个非结合的锌指结构，被认为可介导蛋白蛋白之间的相互作用。经蛋白质结构对比发现，的结构域与,和家族蛋白同源。已有研究证实，在胸腺髓质上皮细胞,调控多种基因表达的自身免疫调节蛋白,的可与核心组蛋白尾巴上的甲基化的赖氨酸残基结合，从而在染色质水平调控基因的表达。万方数据三峡大学硕士学位论文那么我们猜想，的结构域是否也可与其它蛋白质结合并相互作用，参与其对基因表达的调控呢图的功能结构域基因敲除和基因表达谱芯片分析结果显示在小鼠胰淋巴结中，调控大约个外周组织特异抗原基因的表达。本课题组前期已经对这个左右基因的启动子区序列进行分析，结果发现仅有约半数的受调控基因含有能够与的结构域结合的基序，这表明调控这些基因表达不仅仅依靠其经典的转录因子活性，对于那些启动子区不含可结合特异保守序列的剩余约半数基因，可能通过其它尚未阐明的机制进行调控。经典的转录因子调控机制现已明确尚待解决的问题是不含结合基序的受调控基因的表达是如何被调控的呢我们的假说是通过募集和结合其它转录因子，形成复杂的转录复合体，这种复合体再直接或间接地与靶基因转录调节区的元件结合，由此实现对靶基因的转录调控。为检验上述假说，本实验将筛选获得能够与相互作用的蛋白质，为后续鉴定这些蛋白质在介导调节外周免疫耐受过程中的功能及其机制奠定实验基础。万方数据三峡大学硕士学位论文材料与方法.材料主要仪器设备与耗材通风橱实验台湖北科贝科技有限公司型瞬时离心机德国公司型型高速冷冻离心机德国公司型高速冷冻离心机日本日立公司型倒置显微镜日本尼康公司型倒置荧光显微镜德国公司型流式细胞分析仪美国公司多元定量仪美国公司型凝胶成像系统医用线胶片美国公司垂直蛋白质电泳系统转膜系统热循环仪美国公司型电泳仪型水平琼脂糖电泳槽北京六仪器厂型培养箱日本公司型微波炉佛山市格兰仕电器有限公司型旋转混匀仪上海汉诺仪器有限公司核酸蛋白分析系统美国公司型纯水机美国净水设备有限公司超纯水仪美国公司型脱色摇床型台式真空泵江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司型和型电子天平北京赛多利斯仪器有限公司型恒温磁力搅拌器上海亚荣生化仪器厂全波长酶标仪美国公司型精密计上海雷磁仪器厂型负压吸引器天津奥特赛恩斯仪器有限公司超低温冰箱美国公司型低温冰箱，型电冰箱青岛海尔科技有限公司型恒温水浴箱上海跃进医疗器械厂.滤膜过滤器膜美国公司孔孔孔细胞培养板细胞培养瓶细胞冻存管德国万方数据三峡大学硕士学位论文公司细胞培养皿美国公司.和精密移液器德国公司型超声波清洗仪昆山市超声仪器公司型涡旋振荡器美国公司型控温摇床美国公司型生物安全柜新加坡公司试剂与药品.试剂小鼠检测引物和引物的上游及下游软件设计上海生工公司合成聚合酶限制性核酸内切酶和不含的和未预染蛋白质预染蛋白质立陶宛公司逆转录酶试剂盒转染试剂显色液液液试剂盒美国公司高糖液体培养基美国公司美国公司小鼠单克隆抗体和美国公司羊抗鼠二抗北京中杉金桥生物技术公司单克隆抗体小鼠源美国公司试剂美国公司微球菌核酸酶蛋白酶抑制剂，瑞士公司显影液美国公司山羊抗小鼠黄红色罗丹明荧光标记二抗上海研卉生物科技有限公司试剂盒质粒小量纯化试剂盒大连宝生物工程有限公司.药品葡萄糖分万方数据三峡大学硕士学位论文析纯上海试剂厂甲醇三氯甲烷苯酚异丙醇乙醇醋酸钾冰醋酸无水乙醇硫代硫酸钠分析纯无水醋酸钙浓盐酸过硫酸铵郑州市化学试剂厂青霉素链霉素华北制药有限公司巯基乙醇溴酚蓝甘油胰蛋白酶台盼蓝偏钒酸钠氨苄青霉素卡那青霉素北京华美生物工程有限公司美国公司中国医药上海化学试剂公司考马斯亮蓝北京赛驰生物科技有限公司多聚甲醛南通市江天化学品有限公司甘氨酸美国公司胰蛋白胨琼脂粉酵母提取物英国公司琼脂糖粉西班牙公司菌株和质粒菌株菌株由三峡大学分子生物学研究所保存。质粒质粒由三峡大学分子生物学研究所保存。细胞系人胚胎肾上皮细胞株由三峡大学分子生物学研究所保存。小鼠腋窝淋巴结血管上皮细胞购自美国公司，在三峡大学分子生物学研究所传代保存。常用溶液配制.细菌培养用溶液氨苄青霉素母液将.氨苄青霉素钠盐用无菌溶解，定容至。经.滤膜过滤除菌后，用.管按照.管分装，贮存于中。卡那青霉素母液将.卡那青霉素用无菌溶解，定容至。经.滤膜过滤除菌后，用.管按照.管分装，贮存于中。用的量筒取，倒入塑料烧杯中，称取于烧杯中，待完全溶解后，定容至，保存于室温。液体培养基称取胰蛋白胨.酵母提取物.氯化钠.，加万方数据三峡大学硕士学位论文至，用调整至.，再补充至。，高压蒸汽灭菌分钟，待冷却至室温后于保存。液体培养基加入相应体积的抗生素于常温液体培养基中，其中混匀后于保存。固体培养基称取胰蛋白胨.酵母提取物.氯化钠.琼脂粉.，加至，高压蒸汽灭菌后快速倒入直径的无菌平皿，加盖静置直到凝固，倒置后于保存。固体培养基待高压灭菌的液体培养基冷却至左右时，按加入相应体积的抗生素，充分摇匀后迅速倒入直径的无菌平皿，加盖静置直到凝固，倒置后于保存。甘油甘油与等体积混合，高压蒸汽灭菌分钟，冷却至室温后于保存。.溶液称取.，加入的，待完全溶解后定容至，高压蒸汽灭菌分钟，冷却至室温后于保存。.质粒小提所需试剂用量筒量取，经高压灭菌的葡萄糖，.，加入，总体积，充分混匀后置于保存。用量筒量取加入，总体积，充分混匀后置于室温现配现用。用量筒量取醋酸钾，.冰醋酸，加入.，总体积，充分混匀后置于保存。不含的称取.溶解于.中，沸水浴，待冷却至室温，用管按照管分装，置于保存。酚氯仿苯酚氯仿将等体积的氯仿与.平衡苯酚充分混匀后，保存于避光的棕色玻璃瓶中，在液面上层用适量密封。.电泳用溶液琼脂糖电泳缓冲液.称取.，量取.冰醋酸，，加入，调节至.，再补加定容至，充分混匀，于室温保存。使用时用稀释倍。上样缓冲液称取.溴酚蓝.蔗糖，溶解于中，充分混匀，用.管按照.管分装后置于保存。溶液称取.，加入，置于层析柜的磁力搅拌器上充分搅拌混匀过夜，直至完全溶解，然后转移至棕色玻璃瓶中避光保万方数据三峡大学硕士学位论文存。琼脂糖凝胶称取.琼脂糖粉，加入