分类号密级公开硕士学位论文转录因子受与信号的协同调节并能促进肝星状细胞的活化学位申请人张凯学科专业外科学指导教师艾文兵教授吴江锋教授二四年五月万方数据,万方数据三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名日期三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的切法津和经济后果。学位论文作者签名日期万方数据三峡大学硕士学位论文内容摘要目的阐明靶基因在调节活化过程中的作用，并进步弄清在中是否存在与共同调节的表达。方法培养原代肝星状细胞不同天数天后，通过免疫荧光技术检测标记分子和活化标记分子的表达情况通过检测受体及靶基因的表达在细胞中分别高表达及空载质粒后，通过及荧光素酶报告基因技术检测及的表达运用有效封闭转录因子在的作用后，通过荧光素酶报告基因技术检测启动子的活性。结果培养原代肝星状细胞不同天数后，与的表达降低在中高表达与后，结果显示受体能降低的表达而的靶基因却有增强表达的作用在中高表达信号激活型受体样激酶能进步增强激活表达的效应在中高表达信号激活型受体样激酶能抑制激活表达的效应。结论能促进的活化并能被与信号协同调节，选择性阻断表达有可能阻断肝纤维化发生。关键词肝星状细胞肝纤维化万方数据三峡大学硕士学位论文.fl.,.,万方数据三峡大学硕士学位论文目录英文缩略词表引言材料与方法结果第部分通过原代肝星状细胞水平，探讨信号通路相关分子与活化之间的相关性第二部分在水平，进步探讨信号通路相关分子与活化之间的相关性第三部分在水平，探讨信号对靶基因表达的调控作用讨论小结参考文献综述万方数据三峡大学硕士学位论文英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称肝星状细胞平滑肌蛋白信号激活型受体样激酶信号激活型受体样激酶持续活化型受体肉汤培养基积分光密度溴化乙锭乙酸电泳缓冲液聚合酶链式反应互补脱氧核糖核酸乙二铵四乙酸磷酸盐缓冲液联脒苯基吲哚十二烷基硫酸钠四甲基乙二胺过硫酸铵万方数据三峡大学硕士学位论文引言肝纤维化,是由多种病因引起的肝细胞损伤和炎症反应，进而演变为慢性进行性肝病，最终导致肝硬化甚至肝癌的病理过程。由于肝纤维化的发生机制极为复杂，迄今仍缺乏有效的治疗方法。近年来，基础和临床研究显示，肝纤维化甚至肝硬化可能逆转，采取切实可行的抗肝纤维化治疗，是阻止甚至逆转肝纤维化的病理进程，进而达到治疗肝硬化预防肝癌发生的关键。随着分子生物学和细胞生物学技术的发展，人们发现，在肝损伤炎症修复的过程中，以转化生长因子,为代表的炎症因子介导的信号转导激活肝星状细胞进而合成并分泌了以胶原蛋白为主的细胞外基质，及大量的炎性细胞因子，引起了的合成与降解失衡大量的沉积于肝脏导致肝纤维化。在以信号通路为靶点的抗肝纤维化分子治疗的探索中，国内外学者作出了很大的努力，但由于信号的多效性而面临挑战,。由此，寻找与肝纤维化发生更特异更密切的分子，阐明其与肝纤维化形成之间的关系，并以此为靶点进行干预性靶向治疗，抑制的活化，阻断甚至逆转肝纤维化的病理进程，有可能成为预防和治疗肝硬化的有效途径。是炎症条件下诱导活化的重要信号分子，信号通路的活化进步受骨形成蛋白,的负性调节。为组能诱导骨和软骨生成的细胞因子，与同属个蛋白超家族。在活化和肝纤维化形成过程中，和的作用日趋受到学者的重视通过蛋白诱导静止期,活化，上调的表达，抑制上皮细胞钙粘蛋白的表达，从而使活化的转化为肌成纤维细胞促进肝纤维化的形成而通过活化，抑制的下游信号而阻断该过程。和的信号转导在复杂的肝纤维化病理过程中可能起着相互拮抗的作用。经典的信号转导通路是通过相邻细胞间的受体和配体的相互作用而活化，当相邻细胞的配体与受体结合后，受体被酶切释放出胞内区,。转运至核内与首写字母的缩写和转录基金资助国家自然科学基金项目...湖北省卫生厅基金项目.。万方数据三峡大学硕士学位论文激活子蛋白家族，结合,形成三元复合体,使从转录抑制子转变为激活子,促进的靶基因家族成员的转录，在肝脏中主要表现为蛋白分子的表达。信号通路与具有协同作用。研究表明，的下游分子既可结合该信号通路的靶基因启动子上的结合元件又可结合信号通路的下游分子。方面，具有促进信号的作用通过活化蛋白，使其与信号的下游分子直接作用，并结合到基因的启动子上，上调基因的表达。另方面，信号通路也可强化的作用信号通路可以提高的磷酸化水平，增加蛋白的表达量，延长蛋白的半衰期，上调靶基因的表达。此外，这两条信号通路通过协同作用，可以上调的表达，深入研究发现，可以直接活化的启动子，当阻断信号通路时，所诱导的的表达上调受到抑制。该信号通路参与了肺纤维化肾纤维化和肝纤维化的形成。研究显示，在肌成纤维细胞和阳性细胞中的高表达促进了的分泌和的磷酸化，进而诱导肌成纤维细胞的分化，加速肺纤维化的形成。在该过程中，信号通路的活化不仅诱导上皮细胞表达，下调的表达，而且上调胶原蛋白，波形蛋白等标志分子的表达。在活化的的肾上皮细胞和小鼠肾纤维化的组织中，和的表达明显升高。在消化系统的发育过程中，调节着细胞的增殖和分化，在活化的大鼠中，和的表达明显升高，我们的研究也显示，在中随着和胶原蛋白的表达升高而升高。因此，与信号通路均与肝纤维化的形成密切相关，而这两个信号转导通路之间又存在着广泛的“串话”，彼此通过协同作用的方式，使这两个信号的功能得以放大。基于以上研究，表明信号转导通路有可能在肝纤维化的过程扮演着重要的角色。因此，本课题将进步研究信号转导通路在肝纤维化中的作用及其分子间作用机制，期望为临床预防和治疗肝硬化提供条新途径。万方数据三峡大学硕士学位论文材料与方法.仪器和设备主要仪器和设备实验台湖北科贝科技公司通风柜武汉拓普实验室设备有限公司微波炉格兰仕微波炉电器有限公司混匀器美国实业公司吹风机电器常温高速离心机埃普多夫公司数显恒温水浴箱国华电器有限公司微型瞬时离心机美国公司凝胶成像系统美国柯达公司型分光光度计美国贝克曼公司超纯水仪美国公司仪美国公司高性能及梯度仪德国沃特曼公司全波长酶标仪公司药品保存箱冰箱三洋超低温保存箱日本三洋型培养箱日本公司型倒置显微镜日本尼康公司生物安全柜美国公司负压吸引器天津奥特赛恩斯仪器有限公司制冰机宁波格兰特制冰设备制造有限公司各式低温保存箱青岛海尔科技各型电泳仪六仪器厂水平式琼脂糖电泳槽六仪器厂蛋白质电泳系统美国公司荧光检测仪公司主要实验材料及试剂蛋白浓度测定试剂盒公司荧光素酶检测试剂盒公司反转录公司万方数据三峡大学硕士学位论文核糖核酸酶公司脱氧核糖核酸酶公司引物合成，测序上海生工生物工程有限公司小提质粒试剂盒，纯化试剂盒，切胶回收试剂盒美国公司小牛血清白蛋白北京华美公司链酶蛋白酶公司胶原型酶公司无核糖核酸微量离心管生物技术发展中心溴化乙锭公司凝胶电泳用琼脂糖西班牙公司青霉素链霉素华北制药有限公司乙二胺四乙酸二钠公司培养液公司总提取试剂公司胰蛋白酶北京华美公司细胞培养板孔孔公司细胞培养瓶公司胎牛血清公司公司预染中分子量蛋白英杰公司显色液液公司脱脂奶粉美国公司菌株和质粒菌株三峡大学医学院分子生物学研究所保存。质粒质粒由三峡大学医学院分子生物学研究所保存。细胞系大鼠肝星状细胞上海中医药大学赠送抗体单抗公司单抗生物技术公司多抗生物技术公司抗，抗，抗北京中杉金桥公司万方数据三峡大学硕士学位论文标记的羊抗鼠二抗公司主要试剂配制.原代细胞提取试剂配方.左右,.,.,.,.,.,.酶配制液.左右,.,.,.,.,.,.,左右.,.,.,.,.,.,.,.高浓度溶于酶配制液中至低浓度溶于酶配制液中至胶原型酶溶于酶配制液中至.溶于酶配制液中至即可溶于至.细菌培养试剂配方培养基酵母提取物，蛋白胨加定容至高压灭菌保存。培养基使用前向培养基中加入氨苄青霉素钠盐至终浓度为。琼脂平板培养基酵母提取物.，蛋白胨琼脂粉.，加定容至高压灭菌代温度降至左右倒入平板中，每块板约。琼脂平板培养基琼脂平板培养基高压灭菌后，使用前加入氨苄青霉素钠盐至终浓度为待温度降至左右倒入平板中，每块板约。溶液称取粉剂，定容至高压灭菌，冷却后置保存。甘油取丙三醇和混匀高压灭菌，冷却后置保存。.小提质粒试剂配方溶液值毫升，.值.毫升,葡萄糖，加蒸馏水至毫升高压后保存。万方数据三峡大学硕士学位论文溶液毫升，微升，加爽蒸水，定容至毫升，混合，新鲜配制。溶液醋酸钾毫升，冰醋酸.毫升，加蒸馏水到毫升，混和高压后保存。.电泳试剂配方电泳缓冲液按配方称取相应物质，倒入大烧杯中。加经两次过滤蒸馏水至体积为升，用时可再次加水调节为。胶制备称取.粉，倒入玻瓶中，加毫升，加热，至粉末状晶体充分溶解后拿出。在通风处冷却至摄氏度左右。加入适量液，充分混匀后倒在或孔板中。凝固后即可使用。操作过程中要严格注意与皮肤接触。.细胞培养试剂配方细胞培养基称取.和.粉剂溶于后，调值至.。超净工作台内无菌滤器过滤后，置备用。.克氯化钠，.克磷酸二氢钠，.克磷酸二氢钾，氯化钾.克，加双蒸水溶解并定容至。校准值到.，灭菌置冷藏备用。多聚甲醛根据需要称取定量的多聚甲醛，用溶解，为加快溶解速度，可适当加温或加入。多聚甲醛溶解后，再用等量等浓度的混合。度保存。.实验方法原代肝星状细胞的提取液，高浓度，低浓度，Ⅳ，提前半小时放入度水浴乙醚麻醉左右的雄性大鼠，并用酒精浴消毒剖开腹腔，手术线结扎肝下肾上下腔静脉打开胸腔，游离心脏，由右心房行下腔静脉穿刺剪开肝门处血管，用液灌洗约，至肝呈土黄色改用高浓度灌注左右，再用Ⅳ灌注左右取肝脏碾碎，加入低浓度Ⅳ和，度水浴振荡消化小牛培养基终止消化，过滤后分装于毫升离心管，离心后，取上清万方数据三峡大学硕士学位论文,离心后，取沉淀加入重悬，移到毫升离心管中分钟，离心弃上清，重悬沉淀，加两双倍体积的，混匀，覆盖毫升,离心后，取上层与的细胞层，加重悬,分钟离心，弃上清，重复次，细胞沉淀用胎牛血清培养基中培养的提取及.用法提取总用.管收集经不同处理的细胞。加入试剂重悬细胞裂解。待细胞裂解后，按照提取步骤操作。沉淀用无核糖核酸的蒸馏水溶解，紫外分光光度法测定浓度，跑胶鉴定