分类号密级编号硕士学位论文过表达对诱导巨噬细胞凋亡的影响研究生姓名崔淑华指导教师姓名职称庹勤慧副教授学科专业名称药理学研究方向心血管药理年月万方数据南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名年月日南华大学学位论文版权使用授权书本学位论文是本人在南华大学攻读博硕士学位期间在导师指导下完成的学位论文。本论文的研究成果归南华大学所有，本论文的研究内容不得以其它单位的名义发表。本人同意南华大学有关保留使用学位论文的规定，即学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印缩印或其它手段保留学位论文学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。同意学校将论文加入中国优秀博硕士学位论文全文数据库，并按中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程规定享受相关权益。同意授权中国科学信息技术研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。对于涉密的学位论文，解密后适用该授权。作者签名导师签名年月日年月日万方数据目录缩略词表二中文摘要三英文摘要四正文引言实验材料实验方法实验结果讨论结论五参考文献六综述七发表论文八致谢万方数据缩略词表缩写词全称中文名称动脉粥样硬化凋亡信号调节激酶互补脱氧核糖核酸胆固醇环糊精死亡结构域相关蛋白细胞培养基二甲基亚砜溴化乙啶乙二胺四乙酸游离胆固醇氨基末端激酶磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应聚丙烯酰胺凝胶电泳总胆固醇蛋白质免疫印迹万方数据过表达对胆固醇环糊精诱导巨噬细胞凋亡的影响硕士研究生崔淑华导师庹勤慧副教授摘要目的观察对诱导.细胞荷脂与凋亡的影响，为延缓动脉粥样硬化的病理改变提供理论依据。方法人源性基因重组质粒稳定转染.细胞，应用和检测稳定转染细胞内的表达。然后用与.细胞共同孵育，建立.细胞荷脂模型，油红染色和酶荧光法检测细胞内荷脂蓄积情况。检测细胞活性，流式细胞术观察细胞凋亡。测定的表达情况。结果转染细胞经筛选天后，和检测转染细胞内明显高表达，表明稳定转染成功。与.细胞共同孵育后，结果发现高表达组细胞胆固醇蓄积明显，并且细胞活性下调，凋亡细胞数目增加同时转染细胞组蛋白表达明显增高。结论可介导诱导的巨噬细胞凋亡，其凋亡通路可能与上调表达，继之增加下游活性，进步激活有关。关键词巨噬细胞凋亡胆固醇万方数据.,,,,万方数据万方数据引言血管动脉粥样硬化，病变给人类健康带来前所未有的危害，并且呈愈演愈烈的趋势。目前不论是在我国还是在西方的发达国家，所引发的血管疾病都是导致死亡的第杀手。是大中型动脉的种慢性炎症性病理变化，其特点是内膜斑块形成。病变中脂质中心的大小纤维帽的薄厚炎症细胞特别是巨噬细胞的数量和新生血管的多少是决定斑块是否稳定的主要因素。近年来,在的形成和发展中细胞凋亡的作用逐渐成为研究的热点。在早期，凋亡的巨噬细胞可被快速吞噬清除或者移出，并且巨噬细胞的流入减少，这降低了病变细胞泡沫化和斑块进展在的晚期，大量巨噬细胞凋亡造成了脂质中心区域细胞的稀少,由于泡沫化巨噬细胞凋亡后,凋亡的细胞清除不利,进而发生继发性的坏死,导致细胞膜的完整性遭到严重破坏,脂质内容物从胞浆内释放出来并堆积形成脂质池。而这些脂质本身就有细胞毒性,更多周围的细胞会因此凋亡。此外,泡沫化的巨噬细胞可以分泌基质金属酶,促使纤维帽内的细胞外基质降解增加,削弱了纤维帽的抗损伤程度,使粥样斑块的易损性增加。并且坏死促进易损斑块破裂和血栓的形成，这是急性心血管事件形成的主要原因。因此，更深层次的探索巨噬细胞凋亡在晚期动脉粥样硬化中的机制对防御斑块进展是至关重要的。大量文献也显示斑块不稳定的主要因素之是单核巨噬细胞吞噬过多的脂质使胆固醇酯蓄积并诱发凋亡。等观察了多例动脉硬化患者动脉内膜的切除术标本，发现大量吞噬脂质小泡的巨噬细胞存在在斑块和纤维帽部位，其中巨噬细胞凋亡数目在脂质坏死区域明显增多，而增生的内膜与脂质条纹部位凋亡的巨噬细胞分布较少。等也运用光学相干断层扫描照相术比较稳定性冠心病患者和急性冠心病的病灶，进步证实了急性患者脂质斑块和纤维帽部位的凋亡巨噬细胞密度明显高于稳定性患者。因此，稳定斑块的重要途径之是抑制单核巨噬细胞凋亡。在病变中，巨噬细胞凋亡是种慢性累积性反应。其中可促进细胞凋亡的程序包括高浓度的细胞因子如，氧化应激，氧化低密度脂蛋白未酯化的胆固醇，通过配体激活的死亡通路和内质网应激。发现在单核细胞向巨噬细胞转化的过程中，万方数据蛋白内源性配体大量表达，并且用，的突变和抑制抗抗体三种方法证实死亡信号通路是胆固醇诱导巨噬细胞凋亡的主要途径。介导细胞凋亡有两条相互独立的信号通路即依赖于死亡结构域相关蛋白,和不依赖于和其配体结合以后，既可以通过死亡结构域结合羧基末端受体结合域，活化凋亡信号通路诱导细胞凋亡也可以介导细胞内转接器蛋白诱导细胞凋亡。是等用酵母双杂交的方法筛选成年鼠的受体死亡结构域结合蛋白时首次发现的，它广泛分布于哺乳动物和人的正常组织以及肿瘤细胞中。研究发现，可通过信号途径参与许多细胞的凋亡过程，如巨噬细胞心肌细胞成纤维细胞自主神经细胞等。本实验室的前期研究发现在肝细胞的胆固醇代谢中发挥了重要的作用，表明可能参与了的发展。并且在诱导.巨噬细胞凋亡模型上观察到，浓度增加和作用时间延长时，细胞内的荷脂越来越多，的相对表达量呈浓度和时间依赖性增加，凋亡率也呈现了相同的升高趋势。但用去抑制细胞内的表达时，细胞内胆固醇的含量和细胞凋亡率显著降低在诱导巨噬细胞的凋亡模型上则观察到细胞表现为核浓缩，凋亡小体以及致密荧光等特征性形态的改变，这充分提示有可能参与诱导的巨噬细胞凋亡，但是凋亡通路并不清楚。有文献报道，巨噬细胞中，氧化应激可以致使第位的丝氨酸磷酸化并激活，磷酸化可使从核结合体中重新定位，定位在细胞质中的可与结合，活化的将进步激活，诱导凋亡。我们猜测胆固醇是通过这通路来诱导巨噬细胞凋亡的。根据文献和前期的实验，我们提出了以下假设可以使胆固醇环糊精诱导的巨噬细胞荷脂蓄积，并通过激活凋亡通路使胆固醇环糊精诱导巨噬细胞凋亡。本研究拟采用含全长片段的真核表达载体转染于巨噬细胞，观察其对细胞内胆固醇的蓄积和细胞凋亡的影响。万方数据实验材料．细胞株和质粒.细胞来自本研究所.为本研究所保存.为本研究所保存。．试剂.细胞培养基细胞培养基，公司新生牛血清，公司。.试剂盒柱式总提取试剂盒，生工公司上海逆转录试剂盒，公司无内毒素质粒提取试剂盒离心柱型百泰克公司北京蛋白浓度测量试剂盒，碧云天公司江苏凝胶配制试剂盒，碧云天公司江苏预染蛋白质分子量标准，碧云天公司江苏试剂盒，公司。.常用试剂，公司，公司，公司公司蛋白酶抑制剂，公司裂解液，碧云天公司江苏，北京天根公司，公司Ⅱ，北京天根公司，公司万方数据丽春红染色试剂，碧云天公司江苏油红染料，公司。.抗体，公司，武汉博士德生物公司，公司，广州展晨生物科技有限公司以上抗体均保存。，公司保存。，公司保存。.其他显影胶片，柯达公司油红染料，公司其它试剂均为国产分析纯。万方数据．仪器及设备超低温冰箱公司日本制冰机公司日本型电子消毒柜公司超纯水仪恒温水浴箱公司丹麦电子分析天平公司美国微量移液器公司德国生化培养箱医疗器械厂广东型仪公司美国型稳压稳流电泳仪六仪器厂北京型凝胶成像分析系统公司美国培养箱公司美国型超净工作台安泰空气技术公司苏州荧光倒置显微镜公司日本超声波细胞破碎仪新芝科器研究所苏州低温高速离心机公司德国酶联免疫仪公司垂直电泳仪及转膜系统公司美国型脱色摇床金坛市恒丰仪器厂苏州型荧光分光光度计岛津公司日本万方数据实验方法液体和药物的配制.液体培养基胰蛋白胨，酵母提取物，加入去离子，用调节值至.并定容至。固体培养基是把琼脂糖加入液体培养基中。高压蒸汽灭菌，用时加入氨苄青霉素。.培养基包高糖细胞培养基溶在去离子水中，加入.，搅拌至充分混匀，待充分溶解后，去离子水定容至，.微孔滤膜过滤除菌，无菌盐水瓶分装，保存。.缓冲液包粉末溶于去离子水中，盐水瓶分装，高压蒸汽灭菌，保存。胰蛋白酶.胰蛋白酶，.溶于中，用调值至.，定容到，使用.微孔滤膜过滤除菌，分装成每瓶，保存备用。.液.，.，.，.葡萄糖，.，用调值至.，定容至。.溶于液中，用.微孔滤膜过滤除菌，分装成每份贮存于备用。.溶于高压去离子水中，用.微孔滤膜过滤除菌，分装成每份贮存于备用。.缓冲液碱，.硼酸，溶于双蒸水中，加入并定容至，常温保存。.把溶在双蒸水中，温育，调值至.，常温保存备用。.过硫酸胺把.过硫酸胺溶在.去离子水中，冰箱避光保存有效期周。.电泳.，甘氨酸溶于双蒸水中，加入调节值到.，定容至，常温保存。.转移.，甘氨酸.，.溶于双蒸水中，加入甲醇，定容到，常温保存。万方数据..，溶于双蒸水中，用的调节值到并定容至，常温保存。.取的，加入双蒸水和，现配现用。二.质粒的验证取含质粒的菌液稀释倍，然后取涂在含有氨苄青霉素的固体培养基上，置于生化培养箱上倒置培养后，正置培养，待菌落长出后，用移液器挑取单克隆菌落打到液体培养基中含氨苄青霉素，过夜轻摇，取菌液寄上海生工进行序列测定，测序结果与上的序列做同源性分析，剩余菌液提取质粒并同时用质粒验证。三.稳定表达细胞株的建立细胞培养小鼠.细胞为本研究所保存，用高糖培养基辅以标准新生牛血清，把.细胞放到，培养箱中培养，根据情况换液和传代，保持细胞生长状态良好，使用对数生长期的细胞进行所有的试验。.无内毒素质粒的提取吸取过夜培养的菌液，常温离心，弃掉上清，收集菌液沉淀，尽可能的吸干上清把溶液加入到留有菌体沉淀的管中，用涡旋振荡器振荡至彻底悬浮混匀再把溶液加入到管中，上下翻转次使菌体充分裂解，液体会变的清亮然后把溶液加入到管中，立即温和地上下翻转次，使液体充分接触，此时将会有白色絮状沉淀出现，在冰上静置，然后离心，小心吸取上清至.离心管中，冰上预冷在上步所得上清中加入.体积冰预冷的内毒素清除剂，颠倒混匀次，在冰上放置，在此期间颠倒混匀几次，然后水浴，溶液变浑浊，再次颠倒混匀，温育直到溶液分为两相离心，溶液万方数据明显分为两相在上层水相中，内毒素在下层油状相中将含的上层水相转移至新管中，在所得的上层水相中加入.体积的结合液后充分混匀，然后分批向吸附柱中转移液体吸附柱已放到收集管中，离心，倒掉收集管中废液把漂洗液加入到吸附柱中，离心，倒掉滤液，然后此步骤重复次再次把吸附柱放到空收