分类号密级编号硕士学位论文阿司匹林对移植治疗大鼠脑缺血再灌注损伤的影响研究生姓名匡稳定指导教师姓名职称汤永红教授学科专业名称神经病学研究方向脑血管疾病与干细胞移植年月万方数据万方数据南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名年月日南华大学学位论文版权使用授权书本学位论文是本人在南华大学攻读硕士学位期间在导师指导下完成的学位论文。本论文的研究成果归南华大学所有，本论文的研究内容不得以其它单位的名义发表。本人同意南华大学有关保留使用学位论文的规定，即学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印缩印或其它手段保留学位论文学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。同意学校将论文加入中国优秀博硕士学位论文全文数据库，并按中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程规定享受相关权益。同意授权中国科学信息技术研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。对于涉密的学位论文，解密后适用该授权。作者签名导师签名年月日年月日万方数据万方数据目录主要英文缩略索引中文摘要英文摘要论文正文前言材料与方法结果讨论结论参考文献综述综述参考文献攻读硕士学位期间发表的论文致谢万方数据万方数据主要英文缩略语索引缩写英文全称中文名称阿司匹林乙酰水杨酸骨髓间充质干细胞天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶颈总动脉中枢神经系统脑血管疾病颈外动脉苏木素伊红颈内动脉缺血性脑血管病大脑中动脉大脑中动脉阻塞磷酸盐缓冲液翼腭动脉大鼠肿瘤坏死因子万方数据万方数据阿司匹林对移植治疗大鼠脑缺血再灌注损伤的影响摘要目的采用不同剂量阿司匹林干预骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑缺血再灌注损伤，观察各组血清浓度神经功能评分表达，探讨阿司匹林对移植治疗大鼠脑缺血再灌注损伤的影响及作用机理。方法利用线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞模型。根据完全随机原则分为模型自然恢复组组，移植组组阿司匹林干预组组和阿司匹林干预移植组组。组根据阿司匹林的剂量各分为三个亚组阿司匹林剂量亚组.，亚组.，亚组.，组各亚组在再灌注小时后开始按照分组每日予以不同剂量阿司匹林溶入.蒸馏水灌胃给药组为再灌注大鼠模型组组进行移植，于缺血小时再灌注小时后，通过尾静脉注射每只大鼠。第天，分别检测血清浓度，评价神经行为学评分，染色观察细胞形态结构，测定的表达。结果．神经行为学评分单位分组..，组..，组亚组..亚组..亚组..，组亚组..亚组..亚组..。组与组及组各亚组相比具有统计学差异.，组高于组及组各亚组组与组各亚组相比无统计学差异.组与组各亚组相比有统计学差异.，组高于组各亚组组各亚组间两两相比有统计学差异.，组最高，组最低。.血清酶联免疫试剂盒测定单位组..，组..，组亚组..亚组..亚组..，组亚组..亚组..亚组..。组与组万方数据组各亚组及组各亚组相比具有统计学差异.，组高于组组各亚组及组各亚组组与组各亚组相比有统计学差异.，组高于组各亚组组各亚组与组各亚组按剂量两两相比均具有统计学差异.，组高于组组各亚组间两两相比有统计学差异.，组最高，组最低组各亚组间两两相比有统计学差异.，组最高，组最低。.脑组织切片染色显示组神经组织大片坏死，周围残存组织结构不完整，神经细胞水肿明显，大量空泡形成组织明显水肿，神经细胞体积增大，空泡变性，细胞间隙增大组大鼠脑组织结构明显改善较之组坏死区域缩小，梗死灶周围残存组织较多组大鼠脑组织坏死及受损与大致相当组细胞受损较移植组明显减轻，梗死范围缩小，细胞较为完整，间隙水肿轻微，其中亚组神经细胞最为完整，亚组次之，亚组在组中稍差。.免疫组化染色单位个组..，组..，组亚组..亚组..亚组..，组组..组..组..。组与组及组各亚组相比具有统计学差异.，组高于组及组各亚组组与组各亚组相比无统计学差异.组与组各亚组相比有统计学差异.，组高于组各亚组组各亚组间两两相比有统计学差异.，亚组最高，亚组最低。结论阿司匹林在定剂量范围内可促进移植治疗大鼠脑缺血再灌注损伤的效果，其作用机理可能与阿司匹林降低再灌注大鼠血清的浓度及增加降低受损神经的表达有关，且促进作用与阿司匹林剂量相关。关键词骨髓间充质干细胞阿司匹林大脑中动脉梗塞天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶肿瘤坏死因子万方数据,,..,..,..，.万方数据.，.,..,..，..，.,.，.万方数据.,..,..,..，,万方数据万方数据前言据卫生部最新公布的资料表明脑血管病已经成为我国城乡人口死亡和残疾的第位原因，目前经典治疗包过溶栓治疗抗血小板治疗抗凝治疗降纤治疗神经保护治疗中医中药治疗等，经典治疗除早期尿激酶小时内.小时内溶栓治疗外，抗血小板治疗作用较为明确，余均收效甚微。人们期待有种更好的治疗方法，干细胞移植实验不断取得惊人的成就，让缺血性脑血管疾病患者看到了希望，目前干细胞治疗临床试验已有开展，骨髓间充质干细胞大量存在骨髓中，不受取材免疫排斥等限制，倍受重视。但其移植技术仍欠成熟，不确定因素很多，缺血性脑卒如无溶栓治疗及禁忌症，都需要抗血小板治疗，目前应用较多的是肠溶性阿司匹林，有体外实验证明阿司匹林可抑制骨髓间充质干细胞增殖并可诱导其凋亡，不利于移植治疗，但体内与体外有着不同的环境，受很多因素共同影响，国内文献上尚无相关动物实验报导。阿司匹林是非选择性环氧化酶抑制剂的种，主要用于抗血小板及解热镇痛治疗。此外还有其他作用，在缺血性脑血管疾病中它还可发挥清除过量氧自由基而减少损伤的作用，阿司匹林抗肿瘤的研究较多，目前证实它可通过激活和减少发挥抑制肿瘤细胞生长及诱导肿瘤细胞凋亡的作用。体外实验表明阿司匹林可抑制骨髓间充质干细胞的增殖及可诱导骨髓间充质干细胞的凋亡，此作用与剂量呈正相关系。有研究表明，阿司匹林可以通过抑制中性粒细胞引起的炎症反应，起到抗氧化和保护内皮的作用。阿司匹林可减少炎症介质和粘附分子的表达，而减轻局部炎症，增加粥样斑块稳定性。等报道了阿司匹林通过上调蛋白而发挥抑制血管内皮细胞增殖的作用。阿司匹林通过抗血小板的作用可改善缺血性脑卒中缺血半暗带区的微循环并通过多种途径保护缺血受损的神经细胞。缺血性脑卒患者如果没有溶栓且无禁忌症，应在发病后尽早给予阿司匹林毫克每日进行治疗，急性期后予以毫克每日进行二级预防，溶栓治疗患者在溶栓后小时后也应使用阿司匹林。般临床使用剂量的阿司匹林可达到血浆浓度，此浓度在血管内即可抑制血小板的聚集。低浓度时主要主要阻断血小板血栓素的产生，如每日口服阿司匹林就能使血小板血栓素合成酶.受到抑制，高剂量的阿司匹林则使前列环素生成也受到影响。阿司匹林对大鼠脑缺万方数据血再灌注损伤的影响研究剂量在之间均有研究，结果不，但都支持或不否定在以内，随着剂量加大保护作用加强。肿瘤坏死因子是于年首次发现，因其直接导致肿瘤细胞坏死，而取名肿瘤坏死因子，是目前发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之，因其广泛的生物学作用而受到关注。生理状态下，含量极低，但在各种急慢性病症，尤其是急性炎症时，含量急剧升高，有多种，大部分由单核巨噬细胞生成，部分淋巴细胞及细胞等在特殊下也以生成。在神经损伤中起着重要的作用，董峰等在静脉注射骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的研究中，表明正常脊髓神经组织中也表达少量，脊髓损伤后其表达明显增加，骨髓间质干细胞静脉移植治疗后其表达可下降，张义明等血清肿瘤坏死因子对急性缺血性脑卒中患者预后的影响中表明，脑梗发生后天开始增加，天后达到峰值，然后逐渐下降，到天仍高于正常无脑梗死个体，并发现梗死体积越大，神经功能评分越高，血清浓度越高，恢复良好者血清肿瘤坏死因子高于无改善者。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶目前至少发现种，家族成员发挥重要作用，目前已证实有条细胞凋亡基本途径死亡受体途径线粒体途径以及内质网途径，类型不同的细胞可能含有不同的群体，不同的凋亡刺激信号激活的也可能是不同的，但最终都需要通过激活来完成凋亡，在所有已经被发现的家族成员中是最为重要的凋亡执行者。脑缺血再灌注损伤中，直接参与细胞凋亡的发生，是缺血再灌注脑损伤细胞凋亡通路关键酶。骨髓间充质干细胞移植可降低脑缺血再灌注后的表达，从而减少脑缺血再灌注损伤细胞凋亡的发生。免疫组化观察的表达可反应神经细胞受损凋亡的情况。本课题采用不同剂量阿司匹林干预骨髓间充质干细胞治疗大鼠缺血再灌注脑损伤，观察血清浓度神经功能评分的表达的情况，探讨阿司匹林对骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血再灌注损伤效果的影响及可能作用机理，分析阿司匹林在骨髓间充质干细胞治疗缺血性脑卒中的利弊。万方数据材料和方法.实验动物与分组由南华大学动物实验部购买健康清洁级雄性大鼠体重只，要求育龄为个月，编号后随机分组，在同等条件下饲养另购买体重左右，育龄为周的雄性大鼠只，同等条件下饲养，用于培养。实验大鼠分组组，模型自然恢复组组，移植组组，阿司匹林干预组，亚组各只组，阿司匹林干预移植组，亚组各只.主要仪器及试剂主要仪器普通离心机上海安亭仪器厂低温超速离心机公司超净工作台日本公司二氧化碳培养箱美国公司普通冰箱广东科龙科技有限公司冰箱日本公司光学显微镜日本公司倒置相差显微镜日本公司超低温冰箱日本公司高温蒸汽消毒锅苏州净化设备有限公司次性培养瓶公司去离子水机公司次性培养板公司酸度剂德国公司病理组织切片机美国型电子天平北京赛多利公司万方数据手术显微镜上海医用光学仪器厂医用低温电冰箱日本日立公司隔热式电热恒温培养箱上海市跃进医疗仪器厂双极电凝器上海医用电子仪器厂直径.毫米鱼线日本显微外科手术器械上海医用器械厂光学显微照相系统日本公司显微动脉夹苏州医疗器械烤箱上海三星电热仪器厂主要试剂公司淋巴细胞分离液，比重.上海试剂二厂培养基.胰酶胎牛血清,杭州四季清多聚甲醛天津大茂化学试剂厂二甲基亚砜树胶上海生工生物工程有限公司石蜡天津大茂化学试剂厂北京中山生物试剂公司二甲苯天津大茂化学试剂厂多聚赖氨酸粘片剂福州迈新生物技术开发公司水合氯醛南华大学附属第二医院制剂室兔抗鼠单克隆抗体稀释液武汉博士德生物工程有限公大鼠酶联免疫试剂盒上海生研生化试剂有限公司试剂盒武汉博士德生物工程有限公司染色试剂盒武汉博士德生物工程有限公司兔抗大鼠抗体抗