分类号密级编号硕士学位论文黄荆子乙酸乙酯提取物对人鼻咽癌细胞株增殖的影响年月研究生姓名唐洪波指导教师姓名职称沈宝茗主任医师学科专业名称外科学研究方向耳鼻咽喉头颈外科学万方数据南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名年月日南华大学学位论文版权使用授权书本学位论文是本人在南华大学攻读博硕士学位期间在导师指导下完成的学位论文。本论文的研究成果归南华大学所有，本论文的研究内容不得以其它单位的名义发表。本人同意南华大学有关保留使用学位论文的规定，即学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印缩印或其它手段保留学位论文学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。同意学校将论文加入中国优秀博硕士学位论文全文数据库，并按中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程规定享受相关权益。同意授权中国科学信息技术研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。对于涉密的学位论文，解密后适用该授权。作者签名导师签名年月日年月日万方数据目录主要英文缩略语索引中文摘要英文摘要正文前言.材料与方法实验结果讨论结论参考文献综述.成果目录.致谢.万方数据主要英文缩略语索引光吸收值溴化乙啶鼻咽癌细胞黄荆子乙酸乙酯提取物甲氧基硝苯基硝苯基,二磺基苯四唑单钠盐半数抑制浓度吸光度磷酸缓冲液胎牛血清逆转录聚合酶链式扩增反应聚偏氟乙烯膜细胞周期蛋白依赖性激酶社会科学统计软件包.万方数据黄荆子乙酸乙酯提取物对人鼻咽癌细胞株增殖的影响研究生唐洪波导师沈宝茗主任医师中文摘要目的初步探讨黄荆子乙酸乙酯提取物对体外培养的人鼻咽癌细胞株增殖的影响，探讨黄荆子乙酸乙酯提取物在鼻咽癌药物治疗中的应用价值，为其临床应用提供初步的理论依据。方法以人鼻咽癌细胞株为研究对象，将不同溶度.黄荆子乙酸乙酯提取物作用细胞后，用法观察不同溶度.黄荆子乙酸乙酯提取物作用不同时间和后细胞的增殖变化，并计数药物作用的值，用于后续实验将所选择药物浓度作用细胞不同时间和后，用流式细胞仪检测法测定黄荆子乙酸乙酯提取物作用不同时间后细胞的增殖和周期情况采用和检测黄荆子乙酸乙酯提取物作用不同时间后，细胞内细胞周期相关蛋白和的表达情况。结果.比色法结果显示黄荆子乙酸乙酯提取物对细胞增殖有显著的抑制作用，并且呈现出时间和剂量依赖性其值为.。.流式细胞检测法结果显示用.黄荆子乙酸乙酯提取物处理细胞不同时间后，细胞的增殖受到明显抑制细胞比例明显增加，而期细胞明显减少，呈时间依赖性。.结果显示用.黄荆子乙酸乙酯提取物处理细胞不同时间后，细胞中期抑制蛋白表达增高，而期促进蛋白表达降低，呈时间依赖性。.结果显示用.黄荆子乙酸乙酯提取物处理细胞不同时间后，细胞中期抑制蛋白蛋白表达增高，而万方数据期促进蛋白蛋白表达降低，呈时间依赖性。结论.黄荆子乙酸乙酯提取物具有明显抑制细胞增殖的作用，其抑制作用呈时间剂量依赖性。.黄荆子乙酸乙酯提取物抑制细胞增殖可能与通过阻断细胞周期期进展有关。.黄荆子乙酸乙酯提取物抑制细胞增殖可能与其上调期抑制蛋白和下调期促进蛋白表达有关。关键词黄荆子乙酸乙酯提取物细胞增殖抑制细胞周期万方数据.,,.,,万方数据.,.万方数据前言鼻咽癌，是好发于我国南方的种常见的恶性肿瘤，广东广西福建湖南等地高发，而北方则相对少见。流行病学研究发现，头颈部恶性肿瘤中以鼻咽癌的发病率和死亡率最高。鼻咽癌的发生与病毒因素遗传因素和环境因素等具有关系。不同的人群对致病因子的反应性不致，说明肿瘤易感性差异影响鼻咽癌的发病率。近年来，鼻咽癌的发病率和死亡率呈上升趋势，因其大多对放射治疗具有中度敏感性，放射治疗是鼻咽癌的首选治疗方法，但是对较高分化的癌，化学药物的治疗亦属不可缺少的手段。然而，因化疗药物产生的毒副作用和药物耐药性往往导致化疗的失败。研究者们着手在天然植物药物中寻找抗肿瘤新药。长春新碱紫杉醇等药物的研制使用为中药的抗肿瘤带来了希望。但是，临床发现紫杉醇等药物长期使用后，病人亦可产生耐药而导致化疗的失败。因此，需要寻找更为有效的抗肿瘤植物新药。随着生物医药技术的不断发展，中药的提取和纯化得到有效的提高，可以直接对获取的有效部位或是活性成分进行体外和体内抗肿瘤研究。由此可见，为了达到有效治疗肿瘤的目的，从天然植物药物中提取特异性靶向肿瘤细胞的有效部位或是活性药物分子显得尤为重要。黄荆是马鞭科牡荆属植物，广泛分布在我国长江流域及南部各省区，其果实根茎叶均可入药，主治感冒咳嗽哮喘风湿中暑疟疾等。本草纲目对黄荆的药用记载为“黄荆性温味辛苦，归膀胱肝胃经。用于风热感冒头痛，齿龈肿痛，目赤多泪，目暗不明，头晕目眩”。黄荆子系黄荆的果实，药物药理学研究证实黄荆子提取物具有抗炎和解热镇痛作用抗氧化作用,抗菌作用杀虫作用,降血糖作用和调节内分泌免疫作用。通过化学分析方法发现黄荆的化学成分主要包括黄酮类化合物二萜类化合物和木脂素类化合物。如异荭草素白桦酸等。随着对黄荆研究的深入，从黄荆中提取和分离出来的些化学成分显示出了抗肿瘤活性。等从黄荆叶中提取活性成分，多聚甲基黄酮，通过作用于体外培养的人髓系白血病细胞，发现多聚甲基黄酮具有杀伤白血病细胞的作用，其作用机理是抑制白血病细胞的增殖和诱导细胞凋亡。等从黄荆叶中分离万方数据得到具有细胞毒性的黄酮黄荆子黄素，用人类肿瘤细胞作为生物活性测定材料，其结果发现，黄酮黄荆子黄素显示了广泛的细胞毒活性。此外，等从单叶黄荆果实中提取的黄酮类化合物具有特异性诱导癌细胞凋亡和抑制癌细胞生长的作用。等从单叶黄荆中分离的黄酮类化合物，紫花黄荆素，可以介导肿瘤细胞期阻滞和抗有丝分裂活性。而且，等从紫花黄荆素中分离到种二萜类化合物，其显示较强的凋亡诱导和细胞周期抑制作用，其进步研究发现另种化合物，毛地黄酮，可以有效抑制人髓系白血病细胞增殖并诱导凋亡。而等发现单叶黄荆可以通过氧化还原应激诱导人类胃印戒细胞癌凋亡，并且有人用提取出的黄荆子黄素诱导了细胞的凋亡及其凋亡的分子机制。综上所述，我们可以从黄荆这种植物的提取物中寻找到种有效的抗肿瘤细胞生长的物质。因此，黄荆子乙酸乙酯提取物是否对人鼻咽癌细胞具有杀伤作用，其作用机制是什么值得我们去探讨和研究。黄荆子乙酸乙酯提取物是采用现代天然药物化学的提取和分级分离技术从黄荆子植物中提取出来的富含芳基二氢萘类木脂素化合物，前期的研究表明其具有广谱抗肿瘤效应。细胞为人鼻咽癌高分化鳞癌细胞，相对于低分化鳞癌，其对放疗的敏感性差，因此，化疗是治疗高分化鳞癌的主要手段之。为了寻找毒副作用小和疗效好的抗肿瘤药物及抗肿瘤辅助药物，我们以鼻咽癌细胞株为材料，研究黄荆子乙酸乙酯提取物对细胞增殖抑制作用。为证实该科研假说，本课题拟通过应用不同浓度的黄荆子乙酸乙酯提取物体外干预培养的细胞，用法观察不同溶度和不同时间黄荆子乙酸乙酯提取物作用下细胞的增殖变化，并计数药物作用的值，用于后续实验将选择的药物浓度作用细胞不同时间和后，用流式细胞仪分析法测定黄荆子乙酸乙酯提取物作用不同时间后细胞的增殖和周期情况采用和检测黄荆子乙酸乙酯提取物作用不同时间后，细胞内细胞周期相关蛋白和的表达情况。本课题初步探讨黄荆子乙酸乙酯提取物对体外培养的人鼻咽癌细胞株增殖的影响，探讨黄荆子乙酸乙酯提取物在鼻咽癌药物治疗中的应用价值，为其临床应用提供初步的理论依据。万方数据材料与方法.材料.人鼻咽癌细胞中南大学细胞中心.主要试剂和材料黄荆子乙酸乙酯提取物湖南师范大学医学院药物工程实验室胰酶美国公司试剂盒碧云天生物技术研究所培养基美国公司胎牛血清杭州四季青生物工程公司鼠抗人抗体美国公司鼠抗人抗体美国公司辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗碧云天生物技术研究所膜美国公司发光试剂盒美国公司裂解缓液碧云天生物技术研究所引物上海生工生物工程技术服务有限公司引物上海生工生物工程技术服务有限公司引物上海生工生物工程技术服务有限公司琼脂糖英国公司溴化乙碇美国公司试剂美国公司试剂盒美国公司凝胶成像系统美国公司.主要仪器和设备二氧化碳细胞培养箱美国公司超低温冰箱美国公司超净工作台美国公司高压消毒箱日本公司万方数据电子分析天平美国公司计美国公司酶标仪美国公司高速低温离心机美国公司精密烘箱德国公司微量移液器德国公司仪美国公司胶扫描仪美国公司流式分析仪美国公司.主要试剂的配制培养液的配制用烧杯呈新鲜的去离子水，将包干粉倒入去离子水中，加入，磁力搅拌子充分搅拌混匀，值调至，定容至，用.微孔滤器过滤除菌，分装后保存，二周内使用。胎牛血清置于水浴中灭活内毒素分钟，分装后保存。的配制电子天平中称取.，.，.，混合后倒入烧杯中，加入去离子水，充分搅拌溶解，定容至，高压消毒，分装后保存。液的配制电子天平中称取.，.，.，.，.，混合后倒入烧杯中，加入去离子水，充分搅拌溶解，定容至，高压消毒，分装后保存。胰蛋白酶溶液的配制将称取的.胰蛋白酶粉溶解于液中，配制成.的胰酶溶液，搅拌混匀后冰箱过夜，经.微孔滤器过滤除菌，分装后冰箱保存。琼脂糖凝胶的配制万方数据称取琼脂糖溶解于去离子水中，置于微波炉煮沸分钟后，取出冷却至左右，加入溶液，混匀后倒入电泳槽中凝固，备用。聚丙烯酰胺的配制称取丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺溶解于去离子水中，搅拌溶解，用去离子水定容至，.滤膜过滤，调至小于.，保存备用。电泳缓冲液的配制称取.和.甘氨酸，溶解于去离子水中，加后加去离子水定容至，室温保存。电泳转膜缓冲液的配制称取.和.甘氨酸，溶解于去离子水中，加.，用去离子水定容至，加甲醇至总体积为，室温保存。洗脱液的配制称取.和溶解于去离子水中，调至。封闭液的配制称取脱脂奶粉溶于中，搅拌混匀配制成封闭溶液，实验前新鲜配制使用。黄荆子乙酸乙酯提取物溶液的配制称取黄荆子乙酸乙酯提取物药粉溶于中，搅拌混匀配制成储存溶液，实验前新鲜配制使用。．方法.细胞培养细胞培养将从液氮复苏的细胞接种于含胎牛血清的完全培养液中，细胞置于含的细胞培养箱内培养，每日观察细胞生长状况，细胞呈单层贴壁生长。待细胞融合时传代。万方数据细胞传代吸弃旧培养液，用无菌的洗涤细胞后加入胰酶，培养箱内消化细胞，取出后置于倒置生物显微镜下观察，当细胞收缩变圆时，加入含血清培养液终止消化，用移液管轻轻吹打至单细胞悬液，计算细胞，调整细胞密度以接种细胞，用含胎牛血清的新鲜培养液培养，细胞置于含的细胞培养箱内培养。.细胞毒性实验检测黄荆子乙酸乙酯提取物对细胞增殖