硕士学位论文茭白黑粉菌二型态转换的影响因素分析及乙醛酸循环关键基因功能初探作者刘俊平导师叶子弘教授崔海峰副教授学科生物化学与分子生物学中国计量学院二〇四年六月万方数据,万方数据中图分类学校代码密级公开硕士学位论文茭白黑粉菌二型态转换的影响因素分析及乙醛酸循环关键基因功能初探作者刘俊平导师叶子弘崔海峰申请学位理学硕士培养单位中国计量学院学科专业生物化学与分子生物学研究方向微生物分子生物学二〇四年六月万方数据本研究承蒙本研究承蒙本研究承蒙本研究承蒙国家自然科学基金国家自然科学基金国家自然科学基金国家自然科学基金和和和和国家科技支撑计划项目国家科技支撑计划项目国家科技支撑计划项目国家科技支撑计划项目资助资助资助资助万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国计量学院或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名签字日期年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解中国计量学院有关保留使用学位论文的规定。特授权中国计量学院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印缩印或扫描等复制手段保存汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。保密的学位论文在解密后适用本授权说明学位论文作者签名导师签名签字日期年月日签字日期年月日万方数据致谢本论文是在叶子弘教授和崔海峰副教授的精心指导和悉心关怀下完成的，我要深深感谢叶老师和崔老师。学术上，两位导师渊博的学识，严谨的治学态度，对待科研教育认真负责创新的精神，永远值得我学习生活中，老师关心学生，平易近人的人格魅力对我影响深远。在读研的三年时间里，我不仅收获了专业知识，更学会了许多待人处事的人生哲学，在此，谨向恩师表示衷心的感谢和崇高的敬意。本课题的研究工作是在中国计量学院以及浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室完成的，在此感谢课题组的俞晓平老师付贤树老师郝培应老师申屠旭萍老师马正老师陈春老师许益鹏老师王雪艳老师王正亮老师刘光富老师等，你们勤奋严谨的治学精神和对学生的奉献精神，令我受益无穷。感谢师兄金荣愉时鹏涛，师妹金晔余佳佳，师弟言思敏胡鹏李帅，以及马艳陆雯应荣刘卫平陈相波薛承美翁晨晨陈萍等同学，感谢你们在生活学习中给予我的帮助和关照，和你们起度过的这三年时光让我开阔了眼界，丰富了生活，充实了读研岁月，我将永远铭记这段美好的青春时光。感谢我的父母弟弟以及各位亲戚朋友，是你们在物质和精神方面的长久鼓励与支持让我没有后顾之忧，顺利完成学业。最后，谨向所有关心支持和帮助我的领导老师同学和朋友表示再次的感谢，同时向参加论文评阅评议及答辩委员会的专家教授表示诚挚的感谢！刘俊平年月万方数据茭白黑粉菌二型态转换的影响因素分析及乙醛酸循环关键基因功能初探摘要茭白黑粉菌是茭白体内的种内生真菌，其共生能引起茭白茎基部膨大，形成可食用的水生蔬菜茭白。茭白田间有三种表型正常茭白灰茭及雄茭，三种表型与茭白黑粉菌在茭白体内的生长状态密切相关。研究发现，分离自正常茭白茎部的黑粉菌主要以菌丝状形态存在，呈型，而分离自灰茭的黑粉菌主要以孢子形态存在，呈型。目前两种茭白黑粉菌的研究主要集中在形态和蛋白组差异方面，本文系统分析了培养基成分值温度等对茭白黑粉菌体外培养时形态变化的影响克隆获得了个乙醛酸循环途径关键基因的全长序列，比较分析了其在茭白黑粉菌形态变化中的差异表达构建了茭白黑粉菌遗传转化体系，并对克隆获得的基因进行了初步的功能鉴定。分别采用种碳源种氮源种碳氮比组合种不同值的培养基培养分离自龙茭号的型和型茭白黑粉菌，同时使用培养基在培养两种茭白黑粉菌，观察其生长情况。结果表明型茭白黑粉菌只在半乳糖或蔗糖为唯碳源的培养基和等于时出现形态变化，由型向型转变而型茭白黑粉菌在分别以蔗糖葡萄糖半乳糖乳糖甘露醇山梨醇果糖为唯碳源，脲酒石酸胺蛋白胨甘氨酸硫酸胺硝酸钾硝酸胺谷氨酸钠为唯氮源，碳氮比分别为的培养基及分别为时出现形态变化，在体外培养的第天时由型向型转变。在不同温度培养下，环境下茭白黑粉菌生长缓慢，环境下茭白黑粉菌生长较快，形态均未发生变化，时，两种菌均不生长。基于转录组及表达谱数据，选取了在型茭白黑粉菌和型茭白黑粉菌中差异表达显著的基因.和基因.进行克隆和荧光定量。结果表明，基因全长，基因全长，基因和基因在不同的万方数据碳源培养基中培养不同时间的茭白黑粉菌中差异表达明显，以培养基中培养天的型茭白黑粉菌中基因和基因的表达量作为对照，基因在麦芽糖培养基蔗糖培养基葡萄糖培养基中培养天的型茭白黑粉菌中相对表达量分别为.，.，.基因在麦芽糖培养基蔗糖培养基葡萄糖培养基中培养天的型茭白黑粉菌中相对表达量分别为.，.，.，两个基因均在麦芽糖培养基中的表达量最高。利用原生质体转化方法构建了茭白黑粉菌的遗传转化体系。用培养基培养型茭白黑粉菌至.，使用的酶酶解制备原生质体，所得到的原生质体在含有.蔗糖的再生培养基中进行再生实验，再生效果良好。在的介导下，使用线性化的质粒转化原生质体，能获得稳定遗传的转化子。基因敲除菌株的构建。在载体的基础上，利用技术构建了基因的敲除转化载体，经测序和酶切验证载体构建正确采用建立的转化体系转化型茭白黑粉菌原生质体后，通过连续代继代筛选，获得了个再生转化子，鉴定结果发现其中个转化菌株同时具有特征序列和敲除菌株的上下游边界序列，推测原始菌株存在多个拷贝的。与野生型菌株相比，有个阳性菌株体外培养时形态存在明显变化，菌液中有大量菌丝出现，由此可见，在灰茭茭白黑粉菌体外培养的形态变化中具有重要的作用。关键词茭白黑粉菌环境因素二型态乙醛酸循环遗传转化分类号万方数据.,.,万方数据,.,.,,.,.,,.,.,.,,万方数据,.,.万方数据目次摘要.目次.图清单表清单.绪论茭白及茭白黑粉菌的研究进展.茭白起源及生物学研究茭白黑粉菌研究现状.真菌形态变化研究进展真菌形态变化的生物学研究.真菌形态变化的影响因素研究碳代谢与乙醛酸循环.真菌遗传转化方法研究介导法.根癌农杆菌介导法基因枪转化法.电击转化法.限制酶介导法.醋酸锂转化法基因敲除技术研究内容及意义.茭白黑粉菌体外培养形态变化的影响因素分析材料实验菌株主要仪器主要培养基方法万方数据茭白黑粉菌的活化培养茭白黑粉菌生长曲线测定.茭白黑粉菌培养条件设置结果与分析.茭白黑粉菌生长曲线环境因子对茭白黑粉菌的影响讨论乙醛酸循环关键基因的克隆及差异表达分析材料实验菌株主要仪器培养基和试剂.酶和试剂盒方法基因和基因全长的克隆.基因和基因差异表达分析结果与分析.基因和基因全长扩增与分析基因和基因差异表达分析讨论茭白黑粉菌遗传转化体系构建材料实验菌株与质粒.主要仪器主要试剂.方法菌株培养原生质体制备.潮霉素抗性筛选.质粒转化及提取.万方数据质粒的酶切及回收.质粒转原生质体.转化子提取转化子鉴定结果与分析.原生质体制备.潮霉素抗性筛选.原生质体转化.转化子鉴定讨论茭白黑粉菌基因敲除载体构建及基因功能分析.材料实验菌株与质粒.主要仪器培养基和试剂方法目的基因片段克隆及测序.基因敲除载体的构建转化鉴定质粒提取酶切转化原生质体转化子鉴定结果与分析.基因敲除载体的构建转化和鉴定敲除质粒提取酶切和遗传转化转化子鉴定讨论总结与展望.全文总结.课题展望参考文献.万方数据作者简历作者简历作者简历作者简历.万方数据图清单图.型茭白黑粉菌生长曲线图图.型茭白黑粉菌生长曲线图.图.型茭白黑粉菌形态变异统计图.图.型茭白黑粉菌形态变异统计图.图.型茭白黑粉菌形态变异图图.型茭白黑粉菌形态变异图.图.型茭白黑粉菌总电泳图图.基因片段扩增图.图.基因扩增片段和图.基因和基因扩增结果.图.基因全长序列图.基因全长序列图.目的基因片段扩增结果.图.基因克隆片段序列比对结果图.基因克隆片段序列比对结果图.基因标准曲线和熔解曲线.图.基因和基因的相对表达量图.型茭白黑粉菌原生质体图.图.型茭白黑粉菌对潮霉素的抗性筛选图.质粒电泳图.图.型茭白黑粉菌转化平皿图.玉米黑粉菌转化平皿万方数据图.转化子基因验证.图.敲除载体的菌液图.图.敲除载体的构建流程图.图.敲除载体的结构图图.敲除质粒酶切图图.敲除菌株转化平板.图.型茭白黑粉菌转化子菌丝形态.图.转化子鉴定流程图图.鉴定图.基因下游与鉴定.图.基因上游与鉴定万方数据表清单表.基因和基因普通引物信息表.基因和基因引物信息.表.基因和基因引物信息表.菌株与质粒.表.基因克隆引物信息.表.基因和基因检测引物.万方数据中国计量学院硕士学位论文绪论茭白是我国除莲藕外的第二大水生蔬菜，经济效益非常显著。研究发现，茭白膨大茎是其内生真菌茭白黑粉菌与茭白植株互作的结果。目前对茭白和茭白黑粉菌的研究主要集中在茭白的生理生态和茭白黑粉菌的生物学特性等方面。由于对茭白黑粉菌的研究不足，依然无法明确茭白与茭白黑粉菌之间的相互作用。因此，结合茭白黑粉菌的生物学特性从分子水平对茭白黑粉菌进行深入研究将为明确茭白的孕茭机制提供理论支持。.茭白及茭白黑粉菌的研究进展茭白起源及生物学研究茭白又称菰，为禾本科稻亚科菰属水生宿根性草本植物，主要分布于亚洲东部，包括朝鲜日本中国缅甸和印度等地区。未经真菌侵染的野生菰可正常开花结果，其颖果可作谷物食用，叫做菰米，其嫩茎可作蔬菜，称茭儿菜或茭荀真菌侵染后，则会引起花茎组织畸形膨大，形成肥厚的肉质茎，通称“茭白”。茭白在中国有着悠久的历史，我国早在周朝就有食用菰米的记载，唐朝起开始栽培茭白。现在茭白主要分布于淮河流域以南，集中在江苏浙江上海等地。根据采收季节可以把茭白分为单季茭和双季茭，不同品种的茭白采收时间不同，口感风味也各不相同，有的茭白嫩白微甜，有的品种则呈黄白色，甜度较高。茭白具有丰富的营养成分，不仅含糖类有机氮水分脂肪蛋白质纤维无机盐和维生素，还含有赖氨酸等种氨基酸。茭白肉质茎在膨大过程中，短缩茎和叶片积累的养分迅速转移至肉质茎中，而在膨大后期，肉质茎中总糖和还原糖含量明显下降。因此，在茭白膨大的周左右采收的茭白品质和商品性最佳。除作为水生蔬菜，茭白在水稻的分子育种，环境保护等方面也具有重要价值。在医学方面，有研究表明从茭白中提取出来的种分子式为的白色晶体，能有效抑制成骨细胞的反常增殖，可用于预防骨质疏松症。研究发现茭白膨大茎是由茭白黑粉菌侵染茭白万方数据中国计量学院硕士学位论文植株后诱导产生的。正常茭中，茭白黑粉菌以菌丝体的形式存在