方法显示正反向引物值，可以随意更换碱基以提高或降低值同时还能提供引物稳定性参数，包括发夹结构引物二聚体引物相似性等。缺点是不能计算发夹结构引物二聚体响应值。引物在线设计工具及免费软件简介其它在线设计网站引物使用引物标准使用范围，最好特异性改进降低引靶序列，产物呈平头末端。聚合酶聚合酶使用聚合酶标准使用范围特异性改进在建议使用范围内尽可能地降低酶浓度。聚合酶浓度是决定反应成本重要参数，浓度过高不仅能降特异性，同时也导致不必要消耗。准确性改进建议使用高保真聚合酶模板制备与纯化模板与制备模板使用粗样品中抑制剂模板制备与纯化和均可作为扩增反应模板，但般情况下，先逆转录成再进行扩增。模板来源主要有两大类纯净物如重组质粒制备染色体回收片段粗样品如粪便脑脊髓液血液食物动物贝壳土壤尿液唾液福尔马林固定剂组织切片脓汁喷嚏液痰液等上述粗样品含有大量反应抑制物质，因此如何去除这些种类繁多抑制剂或者添加必要反应增强剂显得十分重要。模板制备与纯化从各种粗样品中去除反应抑制剂程序不尽相同，但常用手段包括样品稀释溶剂萃取氯仿﹕异戊基乙醇﹕乙醇沉淀高速离心超滤粗样品中抑制剂粪便胆盐胆红素抑制浓度血液亚铁血红素聚乙醇磺酸钠抗凝剂土壤腐殖物质含铁化合物植物硫酸右旋糖苷食品未鉴定抑制剂痰液未鉴定抑制剂模板使用模板标准使用范围拷贝特异性改进增加模板量降低引物与模板分子比有效性改进增加引物与模板分子比模板浓度变化很大程度上取决于待扩增碱基序列，但般而言，模板长度小，扩增产物量就大，因此对于大分子量模板尤其是真核生物基因组，在扩增之前最好先用超声波处理或限制性酶消化。引物设计原则引物设计及合成引物使用引物在线设计工具及免费软件简介引物设计原则选择合适引物是实验设计重要步骤，合适引物最基本引物长度标准就是与靶序列高特异性杂交。为达到此目，引物设计应注意下列几点理想引物长度应该在个碱基之间，常见是个碱基引物设计原则引物含量引物序列中含量应在之间，最好在范围内。如果因靶序列原因，引物不得不含有过高碱基，那么就在其端设计串或同样，如果引物中含量过高，就在其端设计串或，以便将整条引物含量控制在合适范围内。引物设计原则退火温度引物退火温度般要比估计相应熔点温度低左右，在很多情况下，两条引物退火温度不尽相同，只要两者相差不到，尚不至于影响扩增反应产量，但它们退火温度应在范围引物碱基，内。如果两条引物退火温度差别过大，可以适当延长较低值引物端这样可以保持扩增产物长度不变或端。引物值估算有多种公式，最好根据试剂盒建议计算方法，例如™试剂盒建议计算方法如下引物碱基，长度引物设计原则杜绝互补区域存在引物序列和靶序列各自内部应杜绝互补区域存在。为扩增后操作提供便利条件在不影响扩增反应特异性前提下，可在引物端引入诸如限限制性内切酶识别位点启动子序列等有用非模板序列，以便于扩增后操作。引物设计原则引物与模板互补程度在般情况下，并不要求引物与模板序列达到互补，但检查靶序列上其它可能存在引物同源区域为了减少扩增产物污染本底，在设计引物序列时应检查模板上是否存在潜在引物同源区域。尽可能高互补程度是必要。引物设计原则选择内含子序列作为引物序列在真核生物中，即便是在重复基因不同家族成员之间，其内含引物末端序列在引物两端设置个嘌呤碱基，最好在引物端避免或这样可以在聚合反应开始时增加引物后面碱基掺入机会。引物端子序列也是随机多样性。至少应有个碱基必须是特异性。引物在线设计工具及免费软件简介是种基于数据库便利用于定点突变引物设计工具。只要在网页上相应位置中键入不超过个碱基短核苷酸序列所期望氨基酸序列以及允许替换最大碱基数，设计工具便会提供满足初始要求所有可能引物序列，还能显示酶切位点消失或增加。但个明显缺陷是不能计算引物值并判断其稳定性。引物在线设计工具及免费软件简介!!是种基于引物设计程序，可以选择所期望引物长度最大值最小值误配碱基对数等四种参数输入引物序列其特殊优点是能限定所输入序列中适合引物设计区域，这对检索若干长片段中各种可能引物是很有利。而且能根据三种计算方法显示正反向引物值，可以随意更换碱基以提高或降低值同时还能提供引物稳定性参数，包括发夹结构引物二聚体引物相似性等。缺点是不能计算发夹结构引物二聚体响应值。引物在线设计工具及免费软件简介其它在线设计网站引物使用引物标准使用范围，最好特异性改进降低引般采用∶配比，在最初个循环中，主要产物还是双链，但当低浓度引物耗尽后，高浓度引物引导反应便会产生大量单链原位原位是技术与原位杂交技术结合产物。原位杂交技术可以检测到个拷贝或细胞，而原位技术能使杂交灵敏度提高倍，也就是说人们可以在细胞样品中检测到个拷贝特定序列。个典型原位程序包括下列四个步骤待检测组织或细胞用甲醛溶液固定用蛋白酶对细胞进行通透性处理，确保试剂能进入细胞对或靶序列进行胞内原位扩增扩增产物通常用地高辛系统标记，色谱检测仪检测定量理论上讲，产物以指数规律增殖，但在所有扩增循环尤其是后十轮中，众多引物模板分子上反应由于抑制剂作用并非有效，因此精确定量产物必须使用内标扩增对照。贝特定序列。内标使用相同引物，与待测样品具有相似长度碱基组成以及对抑制剂敏感性，但又必须与待测样品有所区别，以便在扩增产物检测分析时能够辨认如引物检测方式不同。其中，和分别为内标和待测样品初始拷贝数，在∶到∶范围内最佳分别为内标和待测样品扩增产物分子比多重加入多对引物，对同正常人扩增物病人扩增物模板若干区域进行同时扩增。适用于绘制真核生物庞大基因或基因组中缺失图谱，如分子病临床辅助诊断。锚定反转录锚定引物锚定又称为末端快速扩增，主要用于端序列未知扩增和克隆。特异性引物技术在生命科学研究中应用特定序列克隆与重组子鉴定检测基因序列洗牌术染色体引物原位杂交体外定点突变与分析同源重组子检测特定序列克隆与重组子鉴定扩增产物克隆鉴定体外定点突变与分析扩增突变位点变性复性除去引物延伸加外侧引物同源重组子检测同源整合目基因同源交换目基因整合位点扩增扩增检测基因序列将技术与单链构型多态性分析技术联合使用，可以有效地检测和分析基因序列突变性质。在非变性聚丙烯酰凝胶电泳条件下，单链由于分子内作用力而形成卷曲构型，即便是单碱基突变也会导致整条单链构型发生变化，并被检测。采用不对称性程序扩增待分析靶基因序列，获得特异性单链，然后在非变性条件下走聚丙烯酰凝胶电泳，与对照样品进行比较即可检测出可能存在碱基突变类型。染色体引物原位杂交通过荧光探针使染色体发光是细胞遗传学种绘图技术，涉及到荧光原位杂交，和引物原位杂交，程序，用于基因图谱绘制染色体畸形展示基因表达基因组构成感染病定性病毒整合位点调查等方面。是和结合首先使寡聚核苷酸引物与处于期染色体退火，然后在荧光标记核苷酸和聚合酶存在下进行延伸反应，合成系列长度在之间荧光探针，进而绘制细胞染色体彩色图谱。洗牌术随机切割成小片段同源序列混合退火扩增克隆高通量筛选技术在临床医学方面应用检测病原体临床诊断术检测病原体临床上检测病原体通常有三类方法病原菌和病毒生物培养富集病原菌和病毒抗原免疫检测病原菌和病毒核酸特征序列检测相比较而言，检测法在很多情况下不需要培养富集待检测样品这不仅省时，更重要是很多病原微生物难以培养，如些病毒真菌厌氧菌支原体等检测法比免疫分析法更廉价检测法可以使用多重引物同时检测若干种病原微生物。为数不少检测程序已自动化，包括样品预处理扩增反应产物检测。临床诊断术临床疾病诊断术主要原理有下列几个方面检测病变基因缺失或缺损扩增产物变小或无扩增产物检测病变基因点突变扩增产物电泳迁移率改变检测病变基因重排扩增产物大小改变上述方法可以诊断包括各类遗传病恶性肿瘤免疫紊乱在内多种疾病，但始终没有获得美国批准，其主要原因是诊断术检测染色体易位扩增产物大小改变骨髓移植指纹图谱快速配型随机引物扩增检测病变结构扩增产物大小改变可靠性还受到置疑，有时使用不同程序会产生两种截然不同结果。靶序列，产物呈平头末端。聚合酶聚合酶使用聚合酶标准使用范围特异性改进在建议使用范围内尽可能地降低酶浓度。聚合酶浓度是决定反应成本重要参数，浓度过高不仅能降特异性，同时也导致不必要消耗。准确性改进建议使用高保真聚合酶模板制备与纯化模板与制备模板使用粗样品中抑制剂模板制备与纯化和均可作为扩增反应模板，但般情况下，先逆转录成再进行扩增。模板来源主要有两大类纯净物如重组质粒制备染色体回收片段粗样品如粪便脑脊髓液血液食物动物贝壳土壤尿液唾液福尔马林固定剂组织切片脓汁喷嚏液痰液等上述粗样品含有大量反应抑制物质，因此如何去除这些种类繁多抑制剂或者添加必要反应增强剂显得十分重要原理与反应条件聚合酶与扩增精确性模板及制备引物设计及合成反应其它控制参数技术衍生与发展技术在生命科学研究中应用技术在临床医学方面应用聚合酶链反应及其应用技术诞生与发展原理与反应条件技术反应条件技术基本原理反应质量指标技术诞生与发展聚合酶链反应，又称为扩增技术，是种高效快速特异性体外聚合程序。年，美国公司人类遗传研究室发明了具有划时代意义技术年，美国公司推出世界上第台热循环仪，从而使反应自动化年，因发明技术获得诺贝尔化学奖年，定量仪诞生，使定量研究靶序列成为现实。技术基本原理待扩增区域变性加热引物退火底物聚合加热变性退火引物底物聚合加热变性引物退火底物聚合技术反应条件或模板待扩增区域退火聚合循环次目标片段达变性引物聚合酶缓冲液反应质量指标反应质量标准有特异性序列选择有效性序列产量上述三大标准并非由单因素所决定，因此在反应中必须准确性序列对错对多种参数进行联合控制和改进，但由于反应中各参数往往是相互影响，因此任何参数改进不可能同时满足特异性有效性准确性。扩增反应精确性聚合酶与扩增精确性用于聚合酶简介聚合酶对精确性重要影响聚合酶使用扩增反应精确性利用技术扩增靶序列个重要问题是这种体外聚合反应序列忠实程度，即扩增产物序列准确率。反应准确率远远低于细胞内聚合反应，除了缺少完善聚合校正系统外，影响反应准确率因素还包括聚合酶保真性能主要因素链物理损伤反应体系洁净度聚合酶对精确性重要影响聚合酶保真性主要取决于其核酸外切酶活性，它负责对错误掺入碱基进行校正。相关研究结果表明，聚合酶出错率在每轮延伸每核苷酸范围内。聚合酶碱基掺入错误可能发生在其延伸阶段五种活性与结合特异性磷酸二酯键形成速率焦磷酸释放速率碱基错误掺入之后持续延伸性核酸外切活性强弱用于聚合酶简介酶聚合出错率较高，因为它没有核酸外切酶活性和校正功能。然而通过优化反应条件，可使酶聚合出错率降低到原来。聚合酶催化聚合反应普遍则酶还常常导致扩增产物缺失突变。聚合酶错误类型是由转换为如果模板具有形成二级结构可能性避免稀释保存聚合酶聚合酶在室温下也具有延伸引物活性酶在使用时应注意用于聚合酶简介聚合酶是种端缺失了聚合酶，因而没有核酸外切酶活性聚合酶最佳浓度范围很宽，因此很容易优化聚合酶在最佳反应条件下，聚合酶出错率为，性能略优于聚合酶。反