引言材料与方法万方数据三峡大学硕士学位论文英文缩略词表部分在水平，探讨信号对靶基因表达的调控作用讨论乙二铵四乙酸磷酸盐缓冲液联脒苯基吲哚十二烷基硫酸钠四甲基乙二胺过硫酸铵万方数据三峡大学硕士学位论文引言肝纤维化,是由多种病因引起的肝细胞损伤和炎症反应，进而演变为慢性进行性肝病，最终导致肝硬化甚至肝癌的病理过程。由于肝纤维化的发生机制极为复杂，迄今仍缺乏有效的治疗方法。万方数据三峡大学硕士学位论文英文缩略词表引言,万方数据三峡大学硕士学位论文英文缩略词表引言材料与方法结果第部分通过原代肝星状细胞水平，探讨信号通路相关分子与活化之间的相关性第二部分在水平，进步探讨信号通路相关分子与活化之间的相关性第三部分在水平，探讨信号对靶基因表达的调控作用讨论小结参考文献综述万方数据三峡大学硕士学位论文英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称肝星状细胞平滑肌蛋白信号激活型受体样激酶信号激活型受体样激酶持续活化型受体肉汤培养基积分光密度溴化乙锭乙酸电泳缓冲液聚合酶链式反应互补脱氧核糖核酸乙二铵四乙酸磷酸盐缓冲液联脒苯基吲哚十二烷基硫酸钠四甲基乙二胺过硫酸铵万方数据三峡大学硕士学位论文引言肝纤维化,是由多种病因引起的肝细胞损伤和炎症反应，进而演变为慢性进行性肝病，最终导致肝硬化甚至肝癌的病理过程。由于肝纤维化的发生机制极为复杂，迄今仍缺乏有效的治疗方法。近年来，基础和临床研究显示，肝纤维化甚至肝硬化可能逆转，采取切实可行的抗肝纤维化治疗，是阻止甚至逆转肝纤维化的病理进程，进而达到治疗肝硬化预防肝癌发生的关键。随着分子生物学和细胞生物学技术的发展，人们发现，在肝损伤炎症修复的过程中，以转化生长因子,为代表将扩增所得的产物在琼脂糖凝胶电泳上跑胶后，于胶成像系统观察跑胶结果，作为内参。重组质粒的构建引物设计目的基因与启动子片段引物由上海生工合成，具体如下ⅠⅠⅠⅢⅠ目的基因扩增用以上引物,以技术从第链中扩增出目的片段反应体系如表。表反应体系模板缓冲液上游引物下游引物万方数据三峡大学硕士学位论文酶总体积连接将克隆得到的的插入到启动子片段插入到连接。细胞实验免疫荧光实验培养原代肝星状细胞不同天数天后，弃去胎牛培养基，洗次，多聚甲醛固定分钟热洗次，处理细胞分钟热洗次，山羊血清封闭加入稀释的抗室温洗次，加入稀释的二抗标记的羊抗鼠抗体置避光进行抗原抗体反应。缓冲液洗次，染细胞核分钟缓冲液洗次后，每孔加入，荧光显微镜下观看。试剂盒法测定蛋白浓度按照试剂盒操作计算蛋白浓度计算蛋白免疫印迹技术收集不同处理组细胞，用细胞裂解液裂解细胞裂解离心，。收集上清，用中介绍的方法测蛋白浓度。样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳,后，常规电转法将蛋白转移到膜上，。电转后的膜先用含脱脂奶粉的液封闭室温，。洗涤次后，在室温孵育，让抗结合目的蛋白。再次用缓冲液洗次后，加入二抗室温孵育小于。用缓冲液洗次后，使用法显色。荧光素酶试剂盒测酶活性按照试剂盒操作说明步骤操作荧光素酶报告基因分析收集孔板中不同处理组细胞培养基上清于的管中。万方数据三峡大学硕士学位论文离心转分，分钟，冰上放置。从冰箱取出混合好的荧光素酶检测底物置于冰上至完全融化。取出离心培养基上清与荧光素酶检测底物在玻璃管中短暂混匀后，置于荧光仪上检测。万方数据三峡大学硕士学位论文结果第部分通过原代肝星状细胞水平，探讨信号通路相关分子与活化之间的相关性原代肝星状细胞提取及鉴定因含脂滴的,具有较低的密度,利用它与肝脏内其它细胞在不同密度的离心液中有不同的浮密度的原理。采用密度梯度离心法，使得以分离。利用在塑料培养板上培养能模拟天然活化的特性，培养不同天数后在荧光显微镜下动态观察脂滴储存的变化及通过免疫荧光技术检测标记分子和活化标记分子的表达情况。结果显示随着时间的推移，中的脂滴逐渐变少图，静止期表达的分子逐渐减少，和的表达逐渐增多图。图白光下观察培养不同天数后的储脂及形态变化图免疫荧光技术检测标记分子和活化标记分子的表达情况万方数据三峡大学硕士学位论文活化过程中，肝纤维化相关基因及受配体与靶基因表达检测收取培育不同天数天原代，提取总与总蛋白，分别在水平与蛋白水平对肝纤维化相关基因及受配体与靶基因的表达进行检测。水平结果显示肝纤维标记分子在的活化过程中表达显著增加上皮间质转化标记分子在的活化过程中表达显著降低而因子与信号蛋白基本没有变化图。受体在活化过程中变化无规律性，的表达随的活化表达逐渐降低靶基因的表达没有变化，表达降低图。结果也显示靶基因在原代活化过程中的表达降低图。图检测培养不同天数后的纤维化相关基因表达图检测的表达万方数据三峡大学硕士学位论文图检测受体及靶基因的表达第二部分在水平，进步探讨信号通路相关分子与活化之间的相关性在中高表达持续活化性受体能抑制肝纤维标记分子启动子的活性在孔板中培养细胞，待细胞长至左右，将与的启动子共转染到中，后收取培养板中上清做酶活检测。结果显示能抑制肝纤维标记分子的表达图图图,。图荧光素酶报告基因检测的启动子活性万方数据三峡大学硕士学位论文图荧光素酶报告基因检测的启动子活性图荧光素酶报告基因检测的启动子活性在中高表达增强了肝纤维标记分子的表达，对的表达没有影响在孔板中培养细胞，待细胞长至左右，将分别与的启动子共转染到中，后分别收取培养板中细胞做及上清做酶活检测。酶活结果显示能增强肝纤维标记分子的表达图图。结果显示高表达后能增强的表达图。万方数据三峡大学硕士学位论文图荧光素酶报告基因检测的启动子活性图检测表达图荧光素酶报告基因检测的启动子活性万方数据三峡大学硕士学位论文图荧光素酶报告基因检测的启动子活性运用技术减弱转录因子在中作用后抑制了肝纤维化标记分子的启动子表达在孔板中培养细胞，待细胞长至左右，分别将的启动子转染到中培养后将转入中。培养后，收取培养板中上清做荧光素酶报告基因分析。结果显示能抑制的启动子活性图图,。图荧光素酶报告基因检测的启动子活性万方数据分类号密级公开硕士学位论文转录因子受与信号的协同调节并能促进肝星状细胞的活化学位申请人张凯学科专业外科学指导教师艾文兵教授吴江锋教授二四年五月万方数据,万方数据三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名日期三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的切法津和经济后果。学位论文作者签名日期万方数据三峡大学硕士学位论文内容摘要目的阐明靶基因在调节活化过程中的作用，并进步弄清在中是否存在与共同调节的表达。