双链核糖核酸乙二胺四乙酸加强型绿色荧光蛋白表皮生长因子受体酶联免疫吸附试验万方数据三峡大学硕士学位论文胞外信号调节激酶胎牛血清甘油醛磷酸脱氢酶生长激素腺病毒包装细胞辣根过氧化物酶,万方数据三峡大学硕士学位论文英文缩略词表引言第部分基因腺病毒表达载体的构建包装鉴定及纯化材料与方法结果讨论小结第二部分重组腺病毒转染细胞及对其增殖侵袭及分泌的影响材料与方法结果讨论小结参考文献综述万方数据三峡大学硕士学位论文英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称氨苄西林美国模式培养物保藏所骨形态生成蛋白牛血清蛋白环磷酸腺苷互补脱氧核糖核酸细胞病态反应二乙基焦碳酸盐аа感受态细胞改良培养液二甲基亚砜脱氧核糖核酸双链核糖核酸双链核糖核酸乙二胺四乙酸加强型绿色荧光蛋白表皮生长因子受体酶联免疫吸附试验万方数据三峡大学硕士学位论文胞外信号调节激酶胎牛血清甘油醛磷酸脱氢酶生长激素腺病毒包装细胞辣根过氧化物酶马血清卡那霉素培养基感染复数涂布于终浓度为的含抗性的平板上，恒温培养箱培养过夜。从每个平板上挑取个单克隆菌落接种于终浓度为含抗性的培养液中，恒温摇床培养过夜。收取个菌落，用试剂盒小量提取质粒，做酶切，将获取的产物在琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。反应条件万方数据三峡大学硕士学位论文水浴反应重组腺病毒的构建表达框通过同源重组被转移至腺病毒表达载体上将上步获取的正确的产物进行体外同源重组反应体系为腺病毒载体,反应条件反应。用蛋白酶消化重组酶加入蛋白酶，反应感受态а细胞被上步反应产物转化后，涂布于终浓度为的含抗性的平板上，恒温箱培养过夜。从每个平板上各挑取个单克隆菌落，接种于终浓度为的含抗性的培养液中，恒温摇床培养过夜。用小提试剂盒天根提取质粒，用单酶切进步鉴定提取的质粒。反应体系反应条件水浴反应。将上步获取的产物在琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。包装重组腺病毒准备线性化的已制备的重组腺病毒用酶切重组腺病毒质粒万方数据三峡大学硕士学位论文反应体系反应条件水浴反应。酚氯仿异戊醇抽提，乙醇沉淀将酚氯仿异戊醇及缓冲液加入连接产物中并吹打混匀。离心。转移上清至干净的管中。管中加入醋酸钠，吹打混匀，再加入无水乙醇，吹打混匀。冰箱放置，离心。弃上清，酒精洗涤沉淀两遍，室温下敞口放置，待酒精完全挥发后再以充分溶解沉淀。将上步获得的产物线性化重组腺病毒转染细胞。转染前小时在直径为的培养皿里种个细胞。使用™公司，依照说明书，按的比例对达到融会度的细胞进行转染。转染后小时换培养基为含的。转染小时后连续观察细胞病态反应。当细胞出现明显的现象，且有超过半细胞脱壁时，裂解细胞获得病毒，步骤如下收集细胞于的干净离心管中。离心。弃上清并在离心管中加入无菌至离心管中。在干冰浴及间快速反复冻融三次。离心。将上清装于管中置保存，另外用于后继的感染步骤。将上步的裂解上清感染万方数据三峡大学硕士学位论文提前小时在直径为的培养皿里种个细胞。当细胞的融会度超过，在细胞中加入在实验步骤中得到的细胞裂解上清。此后每天观察细胞病态反应。当细胞出现明显的现象，且有超过半细胞脱壁时，裂解收取的细胞获得病毒。如此现象在周内出现则可进行后继实验，如果超过周则说明病毒滴度太低，可重复步骤以提高滴度。放大培养重组腺病毒提前小时在个培养瓶里种个细胞。当细胞的融会度超过，在细胞中加入在实验步骤中得到的细胞裂解上清。当细胞有明显的现象，且有脱壁时即收细胞进行裂解收病毒于无菌中。验证重组腺病毒的产生通过荧光确认因为荧光蛋白真核表达框存在于构建的目的重组腺病毒中，步骤中若有明显的荧光蛋白表达即可说明重组腺病毒包装成功。重组腺病毒鉴定病毒滴度测定细胞培养孔板中接种细胞细胞孔，孔，培养小时。分为干扰组和阴性对照组，接种病毒，按照稀释，各设两个复孔。为空斑滴定病毒滴度标准品。感染后每日观察计数每孔空斑形成情况注本产品检验采用病毒感染荧光观察情况，每孔个以上荧光细胞集落判断为阳性病毒鉴定取病毒，用生理盐水稀释后，按照试剂盒说明书重鼎生物公司提取病毒，用法对重组腺病毒进行鉴定，扩增的引物反应体系和反应条件如下引物反应万方数据三峡大学硕士学位论文反应体系病毒纯化产物反应条件将获取的产物在琼脂糖凝胶中进行电泳。结果靶序列俩俩连接后扩增片段电泳结果用扩增针对预先选定的四个靶序列而设计的模板链，并将它们俩俩链接，扩增俩俩链接后的产物。将获取的产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。图显示及对应的条带清晰，参照提示大小均在左右。万方数据三峡大学硕士学位论文图靶序列俩俩连接后扩增片段电泳结果产物从下往上产物靶序列俩俩连接后与线性化质粒载体连接后酶切鉴定结果和分别与线性化质粒，载体连接后，分别用，做酶切，收集获取的酶切片段在琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，图显示酶切小片段均在左右，大片段均大于线性化质粒，大小正确，说明和已分别与线性化质粒，载体成功连接。万方数据三峡大学硕士学位论文图靶序列俩俩连接后与线性化质粒载体连接后酶切鉴定结果从下往上质粒构建的鉴定结果质粒和用双酶切分别回收大片段和小片段，连接质粒回收大片段与质粒回收小片段就得到了质粒，将获取连接产物转化感受态细胞а，筛选纯化。随机收取个单克隆菌落并描记出方位，用试剂盒小量提取质粒，做酶切，收集获取的酶切片段在琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，图显示号单克隆菌落提取的质粒双酶切后小片段均在左右，大片段均大于，大小正确，说明号单克隆菌落中质粒和已成功连接为质粒。大片段小片段万方数据三峡大学硕士学位论文图质粒构建的鉴定结果从上到下表达框转移至腺病毒表达载体的鉴定结果表达框从上通过体外同源重组被转移至腺病毒表达载体上，感受态细胞а被蛋白酶消化重组酶后的反应产物转化后，筛选纯化。提取单克隆菌落质粒，用Ⅰ单酶切质粒，将单酶切后的产物在琼脂糖凝胶电泳进行电泳鉴定。正确的克隆将切出条约的小条带，且大条带大于说明载体为腺病毒载体，从图可知目的克隆是正确的，将它命名为。图将表达框转移至腺病毒表达载体上后，酶切鉴定结果大片段小片段大片段小片段万方数据分类号密级公开硕士学位论文重组腺病毒的构建及其对细胞增殖及分泌的影响学位申请人李祥骥学科专业外科学指导教师王雄伟副教授二四年五月万方数据,万方数据三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立