﹤﹤﹤,﹤κ﹤﹤,﹤﹤,﹤﹤﹤﹤,﹤育，孵育，终止反应于，分装后保存。准备冰盒将稀释倍，反应体系如下稀释引物上下游各补充无酶水至总体系为轻轻吹打充分混匀，短暂低速离心后按按如下条件进行反应产物储存备用。注各目的基因扩增使的引物序列及大小见表个循环万方数据三峡大学硕士学位论文表所用的引物引物名引物序列产物大小琼脂糖凝胶电泳电泳缓冲液的配制贮存液称取碱，硼酸溶于中，混匀，临用前稀释成使用。操作步骤称量琼脂糖加入于塑料杯中，盖上盖子后微波炉中加热至琼脂糖均匀融化将溶液冷却至后向其中加入，充分混匀装好胶膜和点样梳，将琼脂糖缓慢倒入胶膜中，注意不要产生气泡待胶凝固后，小心移出梳子，将胶放入电泳槽中，并迅速加入足量电泳缓冲液将样品用稀释后进行点样将电泳槽与电泳仪正负极正确连接，使由负极向正极移动，稳压电泳当电泳至恰当时间后，停止电泳，取出胶并在凝胶成像仪上拍照，分析结果。检测各组与效应细胞混培后的增殖情况是种可对活细胞进行荧光标记的绿色荧光染料，可穿透细胞膜进入胞内，与胞内蛋白质结合，且荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减，标记荧光可以平均分配到两个子细胞中去，据此特性，它可被用于检测细胞的增殖。主要试剂的配制万方数据三峡大学硕士学位论文称取加入中，充分溶解混匀后用滤膜过滤除菌。将用按比例稀释为。效应细胞的标记及活化首先取适量磁珠分选得到的效应细胞，用洗涤遍，再加入重悬，随后向细胞悬液中加入新配制的，培养箱中孵育孵育完成后，迅速加入纯血清终止反应，再补充无血清，保证血清浓度为，使细胞维持良好状态离心，再用洗两遍后计数，调整细胞浓度每孔，种于孔板，最后向各孔加入适量的磁珠刺激以活化效应细胞，使其增殖，并设不加者为空白对照孔，于培养箱中培养。刺激细胞的预处理取磁珠分选得到的作为刺激细胞，将其分为组和组两部分，分别加入适量同型对照和封闭抗体，使其终浓度为，培养箱中孵育，使表面的充分封闭孵育完成后调整细胞浓度每孔，将种在孔板内，两组均加入不同浓度的刺激最后，各孔均补充维持细胞活性，培养箱中培养。混培将获得的效应细胞与刺激细胞按照的比例进行混合培养，体外检测对活化的细胞增殖的抑制功能。当刺激达时，收集对应孔内细胞悬液，将其加入活化的细胞中，并设无孔为阴性对照孔，轻轻吹打混匀后于培养箱中培养当刺激达时，同前操作进行混培观察细胞生长及状态，并及时进行换液。检测待混培到第六天时，收集各孔内细胞至流式管，并做好标记离心后用重悬，流式细胞仪检测效应细胞的染色情况。分析效应细胞的增殖情况。万方数据三峡大学硕士学位论文检测细胞表面的活化后κ的表达变化蛋白提取核转录因子κ参与很多基因的表达和调控，是细胞激活的标志。κ蛋白家族以二聚体形式存在，而二聚体中以κ即κ含量最丰富。当细胞处于静止状态时，二聚体与抑制蛋白以三聚体形式存在于胞浆中，当细胞受到等κ激活剂刺激时，抑制蛋白与二聚体解离，暴露出亚基上的结合位点，表现出活性，κ顺势易位进入胞核，进而发挥其转录调控作用。因此，提取细胞的胞浆与胞核蛋白，同时检测κ的表达，以此反应κ通路的活化情况。主要试剂的配制称取溶于异丙醇中，即为，混匀后分装，保存。蛋白提取操作步骤打开离心机预冷，准备冰盒孔板内细胞吹打混匀后将悬液收集至管离心，将上清收集分装后流测，留下细胞沉淀备用室温溶解试剂盒中三种试剂，溶解后混匀，立即放在冰上取，再取适量备用，在需要加入前数分钟内加入至终浓度为按每细胞加入，向细胞沉淀中加入适量的高速剧烈涡旋，把细胞沉淀完全悬浮并分散开冰浴按每细胞加入加入适量的，高速剧烈涡旋，冰浴高速剧烈涡旋，离心，立即吸上清至标记好的预冷的管中，即为胞浆蛋白，注意不要触及沉淀，取留测浓度，余保存对于沉淀，完全吸尽残留的上清，按每细胞加入加入合适体积的，高速剧烈涡旋，把沉淀完全分散开，然后放回冰浴，每隔高速涡旋，共离心，立即吸上清至已标记的预冷的管，即为胞核蛋白，取留测浓度，余保存。万方数据三峡大学硕士学位论文蛋白浓度的检测主要采用法检测蛋白浓度标准品的配制称量加入中，充分溶解后配制成的蛋白标准品，配制后可立即使用，也可以分装后放在长期保存取的蛋白标准品加入到中，充分混匀后配成蛋白标准品，保存备用。检测步骤根据样本数量，按照体积试剂加体积试剂即配制成工作液，充分混匀，其在室温内稳定将标准品按，加入到孔板中的标准品孔中，加补足到加样品至样品孔中，补至各孔内均加入工作液，周围各孔补充用以减少待测孔液体的挥发，孵育酶标仪上检测，据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。蛋白变性将蛋白样自冰箱取出插入冰中，据蛋白浓度测定结果，通过补充和变性上样缓冲液，将各组蛋白浓度调为致后，短暂离心，再仪上使蛋白变性。然后自仪中取出，恢复室温后离心，分装后保存备用。聚丙烯酰胺凝胶电泳主要试剂的配制称量和充分溶于双蒸水中，棕色瓶内避光保存，最长个月。称量加双蒸水至，调至，最终定容至，保存。称量加入双蒸水中，充分混匀后分装，保存。称量加入双蒸水中，调至，最终定容至，保存。称量加入双蒸水中，水浴溶解，分装后保存。电泳液称量甘氨酸加入双蒸水中，万方数据分类号密级公开硕士学位论文通过活化κ途径对调节性细胞的抑制功能起作用学位申请人骆春艳学科专业免疫学指导教师王嘉军副教授二四年三月万方数据三峡大学硕士学位论文κ,万方数据三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名日期三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的切法津和经济后果。学位论文作者签名日期万方数据三峡大学硕士学位论文内容摘要目的天然调节性细胞,即是具有显著免疫抑制功能的细胞，不同种类的活化后对其具有不同的作用。为此，体外研究上膜型与不同配体结合后分泌细胞因子的变化及其对该细胞抑制功能的影响，初步探讨在不同微环境中影响功能的机制。方法采用磁珠分选出健康人外周血的，并用流式细胞术检测分选的纯度。实验分为两组，正常即组和经抗单抗封闭的即组，两组细胞分别加入高中低不同浓度的刺激培养，同时分别设不加或作为