,万方数据万方数据然晾干，于倒置显微镜下观察并拍照。随机选取个视野，计数穿膜细胞数，结果以平均值标准差表示。万方数据三峡大学硕士学位论文小室基质侵袭实验将胶放置于过夜，次日实验前将所有的枪头及小室在冰上预冷半小时用无血清的冷培养基按稀释至终浓度为，在每个孔上室的聚碳酸酯膜上加胶，置于含，温度为的孵育箱中孵育，使胶聚合形成凝胶，吸弃多余液体，加入小室的纯培养基，于培养箱中孵育，使基质胶再水化，然后去除多余的培养液备用。对数生长期的组组及组组细胞撤血清饥饿，次日将细胞消化，离心，沉淀用新鲜不含的培养基重悬，使细胞终浓度为，取悬液加入基底膜已被水化的上室，于下面小室加入含的预冷的。置于饱和湿度培养箱内培养。置于含，温度为的孵育箱内培养，移去小室，湿棉签拭去小室及基底膜上的细胞，甲醇固定，的结晶紫染液染色，流水冲洗，倒置，自然晾干，于倒置显微镜下观察并拍照。随机选取个视野，计数穿膜细胞数，结果以平均值标准差表示。体外球囊形成实验取对数生长期的组组及组组细胞，消化，离心，洗涤次，用含双抗青霉素链霉素的不含的培养液重新悬浮细胞，调节细胞浓度至，取加入超低吸附培养瓶中，然后补加上述培养基至瓶，置于含温度为的培养箱中培养，根据培养基颜色适时换液，培养约周后于倒置显微镜下下随机选取个视野，计数每个视野内形成的球囊，球囊体积可认为是“球囊”，并计算各组“球囊”形成率。每种细胞至少重复次。比色法检测细胞体外存活率取组组及组组细胞，制成单个细胞的悬液，以孔种植于孔板中，加入含的细胞培养液孔，置于含温度为的孵育箱中孵育，吸弃培养液，加入浓度不同的顺铂或的培养基，同时设置不加药物和不加细胞的对照孔和调零孔，每种细胞每个浓度设置个复孔。分别培养后于每孔加入的，于培养箱中培养后弃去上清液，加入孔二甲亚砜，震荡使其充分反应后于酶标仪上检测波长，参比波长处的吸光度值，每组至少重复次。细胞存活率实验孔值调零孔值对照孔值调零孔。万方数据三峡大学硕士学位论文平板克隆形成实验检测细胞体外克隆形成率取组组及组组细胞，使其成为单个细胞的悬液，以孔接种于孔的细胞培养板中，轻轻转动使细胞分散均匀，每孔加入含的培养基，置于含温度为的培养箱中孵育，待细胞贴壁后吸弃培养液，分别加入含顺铂和的培养基，每种细胞每种药物设置个复孔，同时设有未加药物组。置于含温度为的培养箱中孵育，加药组替换为不含药物的培养液，继续于培养箱中静置培养天，根据培养基的颜色适时换液，并观察细胞状态，当出现肉眼可见的克隆时终止培养。弃培养液，洗涤次，甲醇室温固定细胞，弃固定液，结晶紫染色，流水清洗，室温下自然风干，随后于光学显微镜下选取肉眼可见的集落个细胞并计数，并按公式克隆形成率克隆数接种细胞数计算克隆形成率，然后计算细胞克隆存活分数，加药组未加药组，实验重复次，结果取平均值。检测细胞的周期分布取组细胞，使其成为单个细胞的悬液，以孔种植于孔细胞培养板中，每孔加入含的培养基，每种细胞设置个复孔，置于含温度为的孵育箱中培养，待细胞铺满板底后吸弃培养液，收集细胞，并调节密度为的单细胞悬液，缓慢加入预冷的乙醇，固定过夜。，离心收集细胞，洗涤次，加入终浓度为的酶，水浴消化，加入最终浓度为的碘化丙啶液，于避光染色，流式细胞仪检测各组细胞的周期分布情况，计算各组细胞的增殖指数，。实验至少重复次。裸鼠体内成瘤试验检测细胞体内致瘤能力将只裸鼠级雄性，龄，体质量，随机分为组组及组及组组，每组只。取对数生长期的细胞组组及组组细胞消化制成单细胞悬液，计数并调整细胞浓度为，用注射器分别接种上述种细胞于裸鼠左侧前肢皮下，每只注射，即个细胞。接种后饲养于级无菌净化室内。所有动物实验均按照国家研究院动物健康护理指南的原则和程序进行，使用许可证号为。以直径大于为成瘤标准，观察肉眼观察和触诊各组成瘤情况，观察周后采用断颈法处死裸鼠，取出瘤体并拍照，游标卡尺测量并计算瘤体体积，移植瘤体积计算公式其中为最短径，为最长径。万方数据三峡大学硕士学位论文免疫组织化学检测瘤体组织中的表达情况应用免疫组织化学技术检测瘤体组织中的表达情况。取瘤体组织石蜡切片，置于烘箱中烘片，脱蜡至水，洗涤三次微波修复切片缓冲液，中火直至沸后断开电源，时隔低火至沸，自然状况下冷却，洗涤次放入液，常温孵育洗涤，甩干，封闭去除溶液，每张切片加入稀释的抗覆盖组织，同时以代替抗作阴性对照，过夜洗涤甩掉溶液，加入切片二抗，于下共孵育洗涤去除溶液，加入切片现配的液，显色蒸馏水清洗，苏木素重新染色，盐酸酒精分化，流水清洗，氨水使其返蓝，流水清洗切片经酒精个梯度，脱水并干燥，二甲苯用以透明，中性树胶封固，镜检。应用软件处理分析免疫组化图片每组内每张切片随机挑选至少个倍视野进行拍照，拍照时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光致，选取相同的棕黄色作为判断所有照片阳性的统标准，对每张照片进行分析得出每张照片阳性的平均积分光密度值，即累积光密度值面积。每组所有照片的平均值代表该组的，用表示。蛋白定位于细胞膜，故细胞膜具中至强度染色判为阳性染色，。统计学分析采用统计分析软件进行数据的统计，多组间比较采用单因素重复测量数据的方差分析，两样本数据采用两独立样本检验，计量资料以表示，检验水准为具有统计学差异。万方数据三峡大学硕士学位论文结果第部分慢病毒载体的制备及稳定感染细胞株的建立在细胞株中的表达及流式细胞仪分选结果流式细胞仪检测到在细胞中的表达约新分选得到的和细胞通过流式细胞仪检测分选纯度为见图。图分选细胞及分选纯度表示细胞未加抗体的阴性对照表示利用检测得到细胞中细胞占整个细胞的表示刚分选的细胞纯度为。感染效果的评价及被用于检测感染的效果。检测显示相对于组，组基因敲减效率均达到以上，靶向的三个序列均为有效靶点，图和。最后选取和空载体转染目的细胞，检测显示相对于组，组基因敲减效率达到，见图和。检测也显示，与组及组相比，组蛋白的相对表达量明显下降，图。万方数据三峡大学硕士学位论文万方数据分类号密级公开硕士学位论文沉默基因对鼻咽癌类肿瘤干细胞生物学特性的影响学位申请人刘洋学科专业药理学指导教师许新华教授二四年五月万方数据,万方数据三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名日期三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的切法津和经济后果。学位论文作者签名日期万方数据三峡大学硕士学位论文内容摘要目的探讨干扰技术沉默基因对鼻咽癌类肿瘤干细胞生物学特性包括增殖成球分化克隆形成迁移侵袭细胞周期分布体内致瘤能力和化疗敏感性的影响及其作用机制研究。