万方数据三峡大学硕士学位论文,对细胞迁移能力的影响讨论小结参考文献综述后记万方数据三峡大学硕士学位论文英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称动脉粥样硬化冠状动脉粥样硬化性心脏病类趋化因子受体单核细胞趋化蛋白急性冠脉综合症核糖核酸肾上腺素能受体氧化型低密度脂蛋白酶联免疫吸附试验十二烷基磺酸万方数据三峡大学硕士学位论文,万方数据三峡大学硕士学位论文英文缩略词表引言材料与方法结果第部分细胞模型的建立第二部分法检测细胞中蛋白表达量的变化第三部分应用技术检测细胞模型中的量的变化第四部分应用技术检测药物对细胞迁移能力的影响讨论小结参考文献综述后记万方数据三峡大学硕士学位论文英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称动脉粥样硬化冠状动脉粥样硬化性心脏病类趋化因子受体单核细胞趋化蛋白急性冠脉综合症核糖核酸肾上腺素能受体氧化型低密度脂蛋白酶联免疫吸附试验十二烷基磺酸钠逆转录多聚酶链反应焦异丙肾上腺素亚组异丙肾上腺素组醋丁洛尔异丙肾上腺素万方数据三峡大学硕士学位论文组醋丁洛尔异丙肾上腺素组醋丁洛尔异丙肾上腺素。利用阻断剂对细胞进行干预时，先将阻断剂与细胞在培养箱中处理小时后，还要给予激动剂进行刺激处理细胞小时候后收集细胞，进行指标的检测。法鉴定蛋白制备蛋白样品观察细胞状态，密度等。把悬液转移到离心管离心之后，弃上清。用重悬离心，弃上清。向各管中加入细胞裂解液，并用移液枪反复吹打，充分吹匀，置于冰上反应。移至管中，离心，取上清。测定蛋白浓度在孔板中，每个实验组各取蛋白样品与考马斯亮蓝溶液混匀后，用全波长酶标仪测量。以的作为标准品，作为阴性对照，每组各三个复孔。按照公式蛋白浓度待测蛋白蛋白溶解液标准标准蛋白含量计算出细胞蛋白浓度。制备蛋白上样品根据所测蛋白浓度，计算上样体积，然后加入总体积的上样缓冲液，混匀后沸水浴。上样样品保存于。检测洗净玻璃板和梳齿，过单蒸水后，用吹风吹干，对齐两块玻璃板并用夹子夹紧固定好。按照下面的分离胶配方表配制适当体积浓度的分离胶，用加样枪加入到两块玻璃之间的空隙中，不可加的过多，要为浓缩胶留出空间，之后加酒精封胶。万方数据三峡大学硕士学位论文表分离胶配方表分离胶浓度，待分离胶凝固后，倒掉酒精，按照下面的浓缩胶配方表所示配制适当体积的浓缩胶。将浓缩胶加入两块玻璃板之间剩余的空隙中，小心插入梳齿，注意不要产生气泡。表浓缩胶配方表浓缩胶,浓缩胶凝固好之后，安装电泳槽并加入电泳液，缓慢拔出梳齿，注意不要破坏胶。上样预染蛋白质分子量标准品，作为相对分子量标尺,根据各组的蛋白浓度确定每孔的蛋白上样品，将作为上样内参照。在的恒压下，电泳左右，使样品能够迅速进入浓缩胶。之后以恒流进行电泳，使蓝色前沿至分离胶底部。剥胶后，沿凝胶分界线切除浓缩胶，凝胶用于转膜。转膜用甲醇浸泡膜。根据标准品相对分子量标尺，覆盖目的条带区域的凝胶。万方数据三峡大学硕士学位论文以海绵滤纸凝胶膜滤纸海绵的顺序组成三明治夹心结构，浸润在中。将蛋白条带由凝胶转印至膜上左右。转膜后，有色的标准品条带出现在膜上。膜贴近凝胶的面为正面。封闭抗体，显影将膜正面向上置于小盒中，用牛奶在室温下摇床封闭。抗人兔源单抗于制成抗，在室温下结合或过夜后，用洗次，每次。标记的羊抗兔于制成二抗，在室温下结合后，用洗次，每次。加,液后，用荧光显像仪进行显影。获得图片后，使用图像分析软件对内参及目的带进行图像分析，检测各条带灰度值。处理显影后的膜置于中，在左右的水浴锅中静置，期间振荡次，再用洗次，用牛奶重新封闭，进行的后续步骤。检测含量采用试剂盒检测各组中，实验步骤吸取离心后的细胞培养上清作样品准备试剂，样品和标准品加样分别设空白孔空白对照孔不加样品及酶标试剂标准孔待测样品孔温育酶标板加上盖后置温育分钟反应后，弃掉酶标板内的液体，对着吸水纸拍几下将准备好的抗人抗体工作液，按照每孔的量依次加入空白孔除外温育用封板膜封板，然后置于下温育分钟洗涤揭掉封板膜，弃掉液体并甩干，用或进行洗涤，每孔加入洗液，浸泡分钟后换液，共洗涤次依次向每孔中加入备好的工作液空白孔除外，置于下，反应分钟万方数据三峡大学硕士学位论文依次向每孔中加入或，浸泡分钟左右后换液，共洗涤次依次向每孔中加入已经在下平衡分钟的显色液，继续下避光反应分钟终止依次向每孔中加入终止液，蓝色立即变为黄色测定加入终止液后的分钟内，在波长处测定各孔的吸光度值。实验趋化液的制备生长状态良好的细胞中，加入终浓度的，在,条件下培养,再用终浓度的处理细胞，于培养箱中继续培养。收集细胞，离心，保存上清，即为含有的趋化液。处理细胞将细胞随机进行实验分组，用药物处理各组细胞小时后收集细胞，弃上清后用含的培养基重悬，然后置于条件下常规培养。计数细胞，调整细胞密度为。固定小室取含的培养基,加入含的趋化液，将混合液加入下室中，注意不要产生气泡。将小室置入孔板，也要注意下层培养液和小室间避免产生气泡，若有气泡，要将小室提起去除气泡，再将小室放进孔板。取细胞悬液加入的上室，每种浓度要做个复孔。固定好上下室，盖好孔板，将建立好的板，在无菌条件下放入培养箱中培养。细胞的固定染色和计数将小室取出孔板，倒去上室中剩余液体，用清洗次。用多聚甲醛固定分钟，用洗次。用苏木精染色分钟，清洗后浸泡。用棉签拭去膜上表面残留的细胞。利用显微镜观察小室膜下室侧附着的细胞，在高倍镜下取中间和四周的个视野拍照，计数细胞并计算平均值。万方数据三峡大学硕士学位论文对下室内的细胞进行计数。统计学处理应用利用软件进行统计分析。计量资料的实验数据以均数标准差来表示，组间的比较采用方差分析和检验，以值为差异有统计学意义。万方数据三峡大学硕士学位论文结果第部分建立细胞模型在，的条件下，培养细胞小时。用光学显微镜观察细胞的形态细胞呈悬浮状态，形态为圆形或椭圆形，细胞核清晰，可见部分细胞抱团，成簇聚集生长。实验中培养的细胞，其光镜细胞形态学如下图所示图光镜下细胞的形态图光镜下药物处理后开始分化的细胞形态万方数据三峡大学硕士学位论文第二部分应用检测细胞中的表达量用裂解液从各组细胞中提取蛋白后，应用检测的表达水平。用电脑成像系统获得蛋白条带图像，以内参蛋白条带的灰度值作对照，分析蛋白表达的相对量。异丙肾上腺素组不同浓度的异丙肾上腺素处理细胞之后，用检测细胞中蛋白的表达。异丙肾上腺素处理的细胞，的表达水平显著高于空白对照组，且浓度越高，表达量越大，呈浓度依赖性。图检测异丙肾上腺素处理后细胞中的量的变化对照组组异丙肾上腺素组异丙肾上腺素组异丙肾万方数据分类号密级公开硕士学位论文醋丁洛尔与美托洛尔对泡沫化细胞功能影响差别的实验研究学位申请人李丹君学科专业免疫学指导教师周敬群教授二四年五月万方数据