脂质体后，这三种突变体表现出了和野生型样基础酶活性。然而，无法激活其酶活性，这说明三种突变体已经失去了所具有作用连结，从而激活酶活性.。在去垢剂中，和基础酶活性高于野生型然而则略低于野生型。然而值得注意是，和在脂质体中样，这三种突变体在去垢剂中，其酶活性仍然不能为所激活。和缺乏激活酶活性作用相致是，在体外实验中，催化下翻转反应速度过低而难以被准确地测定出来而和则比野生型低了倍，部分。此外，还使用了纯化糖基转移酶。这种酶在空肠弯曲菌中连接糖基化过程有着重要作用，它可以使非还原端最多加上三个残基。我们借此来对位于蛋白脂质体外层可被翻转进行放射性标记，以便可以准确测定由驱动依赖于翻转反应速率。我们通过使用足量，来确保每个分子均被加上了三个分子，以便能准确测定是否翻转到蛋白脂质体内部.。通过用纯化寡聚糖链转移酶把结果中得到寡聚糖链转移到荧光标记受体多肽上，然后再进行分析，从而证实了转变为六糖这过程。体外催化翻转极度依赖于水解。中模体内谷氨酸残基突变会使翻转速率下降倍，这与观察到体内催化活性下降是相致。在存在情况下，酶活性遵循动力学，它值为，与依赖翻转酶值相近。这证实了在驱动催化翻转过程中，水解是必需。和其他转运体样，结合天然底物可以促进水解速度。无论在去垢剂，还是在脂质体中，标准长度和都可以使水解速率提高约.倍，这表明天然末端和支链上葡萄糖残基与激活水解和翻转活性无关。值得注意是，尽管与野生型相比，突变体催化水解和翻转速率都下降了几乎倍，但酶活性还是可以被激活，这说明与相互作用不受突变影响。与相关多药转运体不同是，酶活性激活是高度特异性，如维拉帕米罗丹明和盐酸吖啶黄等常用药物就没有任何激活作用。加入脂质，被称为刺激因子，同样无效。不同状态下结构我们测定了分辨率从.到.内突变型三种晶体结构.。其中两种是这种载脂蛋白高分辨率结构图，并显示出了内部构象分别编名为和而第三种是结合了，这是种全新胞外闭合构象。鉴于后者有限分辨率，我们在建模时借助了个先前发现转运体跨膜部分螺旋在发生构象改变时总是成对变化。此外，我们还通过收集有关晶体和硒代半胱氨酸衍生物反常衍射数据来证实所建立模型。折叠方式和其他转运体相似，正如细菌转运体结构所显示那样。然而，含有个额外短螺旋称之为螺旋。处于细胞膜中，并与膜平面相平行见下。我们使用十二烷基麦芽糖新戊译注原文此处下方为，显示了处于不同状态下结构二醇作为去垢剂，得到晶体，从而获得和胞外闭合结构而则是使用十二烷基麦芽糖苷作为去垢剂而获得。三种晶体结构之间联系是显著，正如结晶情况所显示那样。本项发现揭示去垢剂种类和格子联系，而非蛋白质固有性质，决定了内部构象中核苷酸结合结构域分离程度。但相反是，在对几种转运体核苷酸结合结构和数种分离结构域观察中发现，在胞外闭合状态下排列酷似“封闭两层三明治”。这三种结构之间比较表明主要构象变化包含了种类似于剪刀样运动，也就是说，跨膜螺旋和起朝运动，二者倾斜或者是.。在细胞质周边区，胞外闭合构象和结构整体外部构象不相同，因为存在着个开向转运通道开口。因此，胞外闭合可以在闭合状态抗细菌肽转出体和全外部开放之间进行快速构象改变外部螺旋在相互作用中作用连结跨膜螺旋和环包含外部螺旋。而它周边与跨膜区域相关由数个疏水作用亲水作用和阳离子确定.。其结果就是，在靠近膜外边缘地方，形成了两个疏水沟分别位于和之间.。鉴于它不寻常位置和表面，我们通过研究体内外突变来探寻之间功能联系。我们产生了个缺失突变称为，整个螺旋残基都被段由八个氨基酸残基构成灵活连接体所取代。此外，还产生了个原有残基为残基所取代三突变体，称为，和个涉及稳定性带正电荷氨基酸残基突变二突变体，称为。当重组成脂质体后，这三种突变体表现出了和野生型样基础酶活性。然而，无法激活其酶活性，这说明三种突变体已经失去了所具有作用连结，从而激活酶活性.。在去垢剂中，和基础酶活性高于野生型然而则略低于野生型。然而值得注意是，和在脂质体中样，这三种突变体在去垢剂中，其酶活性仍然不能为所激活。和缺乏激活酶活性作用相致是，在体外实验中，催化下翻转反应速度过低而难以被准确地测定出来而和则比野生型低了倍转运体从朝内状态变为朝外状态剪切运动，这些被包埋，在朝内构象时形成盐桥但是当变为朝外构象或者向胞外闭合时，却暴露出来。因为也许会参与焦磷酸部分结合，我们产生了每个位点单个替换突变和和个所有电荷都缺失了四位点突变。虽然单位点突变体在体内和体外仍然具有定程度催化翻转活性，但是，四位点突变体无法催化翻转.，。而且，虽然单位点突变体酶活性可被定程度激活尽管基础酶活性有所下降，但是四位点突变体酶活性却无法被激活.，这也就说明了和突变型之间相互作用有了明显下降。翻转机制日积月累生化和结构资料让我们提出了个催化翻转机制，如.所示。与催化活性相关两种构象分别称为向胞外闭合构象结合状态和朝外构象结合状态。鉴于细胞内和浓度只有微摩级，转运体分离状态，以种朝内结构为代表，可能是短暂而稀少。和之间快速交换，不会允许同二聚体蛋白所有结合部位同时处于种未结合核苷酸状态。我们提出这样种假设，当多聚异戊二烯尾与表面及其周边相互作用时，其焦磷酸部分直接进入结合状态时外部穴中，并与残基之间产生静电作用。而寡聚糖链部分则跟随焦磷酸部分，但在转运过程中不需与产生任何特定相互作用。这也就能够解释翻转反应对多糖长度低选择性或者低特异性。这假说与观察到可转运通常由型翻转酶所转运不同。这也可以说明相关型翻转酶是如何在菌体抗原产生过程中转运长直线型高聚糖链因为延长了寡聚糖链被想象为直接滑进面向外部转运路径中，然后停留在外表面，所以不存在对糖连长度限制。在我们模型中，催化翻转反应驱动力来自两个方面。首先，在转运过程中，水解会导致被迫分开以便于产物释放，这运动传到后会产生种施加于底物上压力。这也许会让人回想起维生素转运体催化机制中提出蠕动转运部分。其次，旦焦磷酸和寡聚糖链部分已经扩散到转为途径之外后，极可能会变为向胞外闭合构象，这点正如在结合时结构所观察到样，从而有效关闭了在底物后面门。我们假设，水解所释放能量主要是用于打破焦磷酸部分和排列在外部穴内残基之间相互作用。那么就有理由认为，堆积在细胞质侧含焦磷酸会充当翻转反应催化过程中抑制剂，这也许会导致体外实验中翻转速度随时间流逝而下降。在体内，如果十异戊二烯焦磷酸在转运多糖后堆积在胞内，也会出现相似问题但这可能会因十异戊二烯焦磷酸被催化水解生成单磷酸类物质而缓解。我们推断出来催化下翻转机制与翻转酶催化磷脂翻转“刷卡”模型有些相似。不过有两个重要区别是多聚异戊二烯尾借由与表面相识别，二是在翻转过程中需要个长足够宽可以容纳下焦磷酸和官井头路部分转运通道。我们机制与作用机制是有区别，那机制认为整个脂质核心都应该是进入了转运体内部无核苷酸状态中。更概括说，我们提出这个假设与用于解释转运小亲水底物转运机制交替通路模型也是有区别。结论我们结果确定了转运体催化脂连接寡聚糖链翻转过程结构和机制基础。这些资料揭示了种适用于含有焦磷酸部分和线性多聚糖链大头部基团翻转机制。头部基团在转运过程中被脂双层所保护。我们测直接进入朝外构象和脂肪尾与转运体朝膜表面相互作用也许会是其他类型翻转酶个特征，甚至也或许是在细菌细胞壁形成或者真核细胞中连结糖蛋白翻转起催化作用类转运体个特征。理解翻转过程分子机制也许会为我们打开个新通往了解细菌糖基化机制大门。中文字出处,.脂连接寡聚糖翻转酶的结构与催化机制镶嵌在膜中的脂类具有较大的极性头部基团，它们的翻转过程是缓慢的，并且极为不利的。因此，这过程需要翻转酶来催化，但其催化机制却是未知的。个关于翻转反应的著名例子是可在蛋白质，部分。此外，还使用了纯化糖基转移酶。这种酶在空肠弯曲菌中连接糖基化过程有着重要作用，它可以使非还原端最多加上三个残基。我们借此来对位于蛋白脂质体外层可被翻转进行放射性标记，以便可以准确测定由驱动依赖于翻转反应速率。我们通过使用足量，来确保每个分子均被加上了三个分子，以便能准确测定是否翻转到蛋白脂质体内部.。通过用纯化寡聚糖链转移酶把结果中得到寡聚糖链转移到荧光标记受体多肽上，然后再进行分析，从而证实了转变为六糖这过程。体外催化翻转极度依赖于水解。中模体内谷氨酸残基突变会使翻转速率下降倍，这与观察到体内催化活性下降是相致。在存在情中文字出处,.脂连接寡聚糖翻转酶结构与催化机制镶嵌在膜中脂类具有较大极性头部基团，它们翻转过程是缓慢，并且极为不利。因此，这过程需要翻转酶来催化，但其催化机制却是未知。个关于翻转反应著名例子是可在蛋白质连接糖基化作为供体脂连接寡聚糖转位。在空肠弯曲杆菌中，这过程是由种转运体催化。基于不同状态下晶体结构，我们在此提出个由催化脂连接寡聚糖翻转机制。在体外，能够运用内部和外部构象，但是只有外部构象才是催化翻转反应所需要。当脂连接寡聚糖链焦磷酸寡聚糖链头部基团进入了转位腔后，会与周边肽链上正电荷发生相互作用而脂质多聚异戊二烯尾则结合并激活该转运体，但在翻转过程中，它仍位于脂双层中。我们所提出这种机制与适用于其他转运体经典交替通路模型是有本质区别。脂质从膜侧转至另侧，被称为翻转，这不仅是维持膜不对称性所必须，而且也是许多生化过程基础，比如说，信号传输分泌和细胞内吞中囊泡形成膜蛋白活性调节和蛋白质天冬氨酰残基糖基化。在动物中，脂质双分子层两侧不对称性影响着许多活动，比如说凝血作用巨噬细胞识别过程和细胞凋亡。在细菌中，细胞壁成分前体物质被耦联在脂质载体中，随着脂质翻转而运出细胞外，这对细胞壁形成来说是极其重要。翻转反应是由主动，或者说活跃转运体蛋白所催化。这些蛋白包括通过消耗能量使得脂质在双分子层随机分布爬行酶，由或驱动对向运输载体，和由驱动定向转运特定脂质转运体。后者包括和转运体。尽管有了广泛研究，但关于由翻转酶催化脂质快速翻转反应过程和机制仍然知之甚少。直到现在，只有细菌翻转酶核心蛋白晶体结构被报导公布出来，但是根据这点资料无法推断出任何相关机制。除了缺乏结构方面资料外，可用于天然底物翻转反应研究可靠体外试验分析也太稀少。原核生物翻转酶种主要底物是，种脂连接寡聚糖，它可以从内质网膜胞质侧转移至网腔侧，然后寡聚糖链被转移到新合成肽链天冬氨酸残基上，从而形成蛋白质连接糖基化。在同源细菌连接糖基化途径中，种化学结构类似在人类致病菌空肠弯曲菌中出现了翻转。作为该过程催化酶，是种同二聚体转运体，并且在细菌蛋白质连接糖基化过程中是必不可少。在寡聚糖链转移酶作用下，已翻转寡聚糖链部分被转移到受体蛋白质上而十异戊二烯焦磷酸盐部分然后在十异戊二烯焦磷酸酶催化下水解为单磷酸盐。为了探明由驱动翻转反应机制，我们研发出了体外分析方法，并测定出了空肠弯曲菌在不同状态下晶体结构。我们研究结构揭示了这样种机制只有外部构象与翻转反应有关，从而在允许寡聚糖链穿过转运蛋白情况下，而附着在表面多聚异戊二烯尾仍然部分嵌在脂双层中。这新提出机制与用于解释目前研究大多数转运蛋白催化机制交替通路模型迥然不同。体外实验中催化翻转和水解活性人们之前已经采用放射性同位素标记天然脂质来研究多聚异戊二烯连接寡聚糖翻转过程。然而我们发现无论是在体外还是在体内，都可以催化寡聚糖链有所缩短。于是，我们再重组和种糖链部分为三糖，得到了种蛋白脂质体。这种蛋白脂质体.有个还原末端和两个乙酰半乳糖胺，部分。此外，还使用了纯化糖基转移酶。这种酶在空肠弯曲菌中连接糖基化过程有着重要作用，它可以使非还原端最多加上三个残基。我们借此来对位于蛋白脂质体外层可被翻转进行放射性标记，以便可以准确测定由驱动依赖于翻转反应速率。我们通过使用足量，来确保每个分子均被加上了三个分子，以便能准确测定是否翻转到蛋白脂质体内部.。通过用纯化寡聚糖链转移酶把结果中得到寡聚糖链转移到荧光标记受体多肽上，然后再进行分析，从而证实了转变为六糖这过程。体外催化翻转极度依赖于水解。中模体内谷氨酸残基突变会使翻转速率下降倍，这与观察到体内催化活性下降是相致。在存在情况下，酶活性遵循动力学，它值为，与依赖翻转酶值相近。这证实了在驱动催化翻转过程中，水解是必需。和