1、心弃上清，用重悬裂解细胞再向上述管中加入氯仿，上下颠倒混匀，置冰上，待液相分层后，离心离心后，取上清至新的管后，向其中加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀后，置冰上，离心离心后弃上清，加入乙醇水配制，将沉淀轻弹起，置冰上，离心弃上清，负压吸去管壁残留液体，置超净工作台中待乙醇充分挥发后，加入水溶解沉淀，获得细胞的总，置储存。万方数据三峡大学硕士学位论文的合成在管中，依次加入的，补足至总体积，混匀后，在仪上以孵育，转冰上静置。再向上述管中依次加入在仪上以反应，反应后终止反应取出管置冰上，获得的可储存于冰箱。靶基因的合成以上述反转录获得的作为模板，以。
2、文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名日期三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础。
3、液左右若是连接产物怎全部接种均匀涂抹接种到预热后的平皿培养基上，放置入恒温培养箱培养小时左右。当有单菌落生成，即可挑取单克隆。碱裂解法提质粒挑取阳性克隆转接到液体培养基中，摇床振荡培养过夜。将上述菌液分装到管中后离心。弃上清后，每支管分别加入溶液重悬沉淀后，再分别加入溶液，轻轻混匀后，当出混合液出现拉丝现象时即需迅速加入溶液，轻轻上下颠倒混匀，至出现白色絮状物后，放置冰上，万方数据三峡大学硕士学位论文然后于离心离心后，避开白色絮状深沉，将上清吸取至新的管中，加入等体积酚氯仿，上下颠倒充分混匀后，置冰上，离心离心后，避开有机层和蛋白层，将上清。
4、不同的引物进行，引物序列如下上游引物下游引物上游引物下游引物反应体系反应体系预变性变性退火延伸，个循环后，延伸结束。取产物混合后于琼脂糖凝胶中电泳，最后用凝胶成像分析系统观察并记录分析结果。荧光素酶报告基因质粒的构建靶基因序列的设计及合成从人类基因组数据库中获得基因序列的段的靶序列，设计靶序列，并引入酶切位点ⅠⅠ和保护碱基。由上海生物工程有限公司合成。万方数据分类号密级公开硕士学位论文通过下调抵抗化疗药物作用的机制研究学位申请人辛丹丹学科专业妇产科学指导教师佐满珍主任医师刘朝奇教授二五年五月万方数据，万方数据三峡大学硕士学位论文三峡大学学位。
5、，显微镜下计数四大格细胞总数，对压线细胞按“计左不计右，计上不计下”原则计数然后按公式计算细胞数四大格细胞总数细胞转染质粒瞬时转染提前将细胞接种到六孔板中，当培养至细胞生长密度至左右，即可按转染试剂盒说明书进行细胞转染转染前小时，将六孔板中的细胞培养液换成细胞培养液万方数据三峡大学硕士学位论文分别用培养基稀释质粒及脂质体，轻轻混合吹匀，室温下静置分钟。将上述稀释后的质粒加入稀释后脂质体中，轻吹混匀后，再室温下静置分钟。将上述混合物缓慢多点滴加到待转染六孔板细胞培养液中，置，恒温培养箱中培养。培养小时后将细胞培养液更换成完全培养基，继续培养小。
6、组稳转细胞，再加药处理后，检测荧光素酶活性荧光素酶活性高低与表达水平负相关，发现转染后，荧光素酶活性显著升高而空载组加药后荧光素酶活性明显降低组加药后，荧光素酶活性又有所降低，但变化没有前者显著，说明是潜在个靶基因。将与重组报告基因共转染细胞，发现组转染较转染荧光活性降低，而空载组转染较转染荧光活性显著增高，进步说明是潜在个靶基因。结论癌基因能够提高对多西他赛化疗药物耐受性能够通过下调，引起细胞周期蛋白表达增加引起多西他赛化疗药物耐受的机制可能与诱导的下调，导致其靶基因的高表达，抵抗细胞凋亡有关。关键词化疗耐药Ⅱ万方数据三峡大学硕士学位论文。
7、，向孔板中加入不同浓度药物多西他赛，每个浓度至少设置个复孔，继续培养小时小时小时和小时，在指定时间点，负压吸去孔内的细胞培养液，再分别加入溶液，置含的恒温培养箱中继续培养小时。小时后吸去孔内上清后，再每孔加入，避光，在室温下震荡，溶解紫色结晶，用多功能酶标仪在处的波长处检测吸收峰值。细胞的抑制率细胞抑制率对照组实验组对照组感受态细菌的制备万方数据三峡大学硕士学位论文将冻存于负冰箱的大肠杆菌菌种取出，在固体培养基平皿上以划线法接种，于恒温培养箱培养小时。挑取细菌单克隆，接种至事先加入的液体培养基的管中，置摇床振荡培养过夜。将上述管中菌液，按的。
8、构建及功能分析拟定的类似物抑制剂与重组报告基因共转染细胞后的功能分析。结果结果提示多西他赛对稳定转染的细胞的抑制率较之对转染空载的细胞的抑制率明显降低检测拟定表达情况发现，在转染后的表达降低，转染空载质粒的细胞加药后表达显著增加，转染的细胞加药前后表达变化不明显通过计算机预测分析软件发现是的个潜在靶基因检测细胞周期相关基因细胞周期相关蛋白激酶表达变化发现，转染后表达明显增高空载组加药后表达明显降低而转让组，加药后表达变化不明显检测蛋白水平表达变化与基因表达水平相致成功构建荧光素酶报告基因，经过测序鉴定结果正确。将构建的荧光素酶报告基因转染两。
9、时后用于后续实验检测。与质粒共转染提前将细胞接种到六孔板中，当培养至细胞生长密度至左右，即可按转染试剂盒说明书进行细胞转染转染前小时，将六孔板中的细胞培养液换成细胞培养液分别用培养基稀释质粒及脂质体，轻轻混合吹匀，室温下静置。将上述稀释后的质粒加入稀释后脂质体中，轻吹混匀后，再室温下静置分钟。将上述混合物缓慢多点滴加到待转染六孔板细胞培养液中，置，恒温培养箱中培养。培养小时后将细胞培养液更换成完全培养基继续培养。用法检测细胞的增殖细胞计数后调整细胞密度至个，以每孔细胞悬液接种到孔板中，周边孔中加入，置含的恒温培养箱中培养。当细胞生长密度大时。
10、吸取到新管中，加入无水乙醇，上下颠倒充分混匀后，置冰上，离心离心后将上述管置冰上后弃上清，加入乙醇，将沉淀弹起后，离心。离心后弃废液，并用负压吸去管壁残留液体，将管打开置通风处，室温放置左右，使乙醇充分挥发。加入溶液，轻吹混匀后，置恒温水浴箱消化将提取到的质粒加入到已配好的的琼脂糖凝胶上样孔中，以稳流电泳左右，于凝胶成像系统显像，初步评估质粒提取质量与浓度核酸浓度测定提前启动仪器，预热。将提取的质粒与按比例稀释用清洗比色皿三次后，以作为空白对照标定仪器两次，再次检测待检质粒的浓度，记录相应数值半定量法提取总按常规方法收集细胞至无的管中后，离。
11、体积比例转接至新鲜配制的液体培养基中，摇床振荡培养小时左右。将上述菌液平均分配到个高压灭菌后的圆底离心管中，离心。弃上清，分别用预冷溶液重悬管沉淀，混合为管后，置冰上冰浴，离心。弃上清，用预冷溶液重悬沉淀，置冰上冰浴，离心。丢弃上清，用预冷溶液重悬沉淀，向重悬液中加入无菌甘油，充分混匀后以管分装置离心管中，负冰箱储存。质粒转化将储存于负冰箱的感受态细菌取出，置冰上溶解。取质粒或全部连接产物加到感受态细菌中，轻轻吹混匀，冰上放置。将混合后的感受态细菌置于水中热激秒，再置冰上。在超净台内向上述混合液中加入液体培养基后，摇床振荡培养分钟。取培养后。
12、所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的切法津和经济后果。学位论文作者签名日期万方数据三峡大学硕士学位论文内容摘要目的本研究的目的是以作为视角，对宫颈癌相关病毒人乳头瘤病毒引起肿瘤细胞抵抗化疗药物的作用机制进行研究。方法法检测不同浓度多西他赛对稳定转染和基因的细胞抑制率检测细胞周期相关基因的表达变化检测拟定表达情况计算机分析软件预测拟定的潜在靶基因检测潜在靶基因的蛋白表达水平变化重组荧光素酶报告基因质粒的。
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